Bezpečnostné opatrenia pri používaní ultrafiltračnej trubice
(1) Vyberte vhodnú ultrafiltračnú trubicu. Všeobecne platí, že molekulová hmotnosť, ktorá sa má zachovať, by nemala byť väčšia ako 1 / 3 molekulovej hmotnosti cieľového proteínu. Napríklad, ak je molekulová hmotnosť cieľového proteínu 35kDa, môže sa zvoliť ultrafiltračná trubica s molekulovou hmotnosťou 10kDa. Ak je molekulová hmotnosť cieľového proteínu asi 10kd, môže sa použiť ultrafiltračná trubica s molekulovou hmotnosťou 3KD. Pozorne si prečítajte návod na použitie a venujte pozornosť odlišnej tolerancii ultrafiltračnej membrány na rôzne chemikálie.
(2) Novo kúpená ultrafiltrácia je suchá. Pred použitím pridajte ultrapurovú vodu a voda úplne prejde membránou. Predchladnite ho v ľadovom kúpeli alebo chladničke na niekoľko minút. Potom vylejte vodu a pridajte proteínový roztok. Pridané množstvo nesmie prekročiť bielu čiaru v hornej časti trubice. Operácia by mala byť ľahká. Pred pridaním proteínového roztoku je potrebné ultrafiltračnú trubicu vložiť na ľad na predchladenie.
(3) Zostatok. Hmotnosť aj ťažisko by mali byť vyvážené. Všimnite si, že rýchlosť a zrýchlenie by nemali byť príliš rýchle, inak bude ultrafiltračná membrána priamo poškodená. Začnite odstredivú ultrafiltráciu (odstredivka predchladením na 4 stupne). Po otáčkach rôznych centrifúg sa premení na G, je to iné. Nastavte zrýchlenie odstredivky na najnižší prevodový stupeň, aby sa znížil tlak na membránu. Všimnite si, že musíte počkať, kým odstredivka nedosiahne cieľovú rýchlosť pred opustením odstredivky, inak, keď sa vyskytne problém s centrifúgou, nemôžete sa s ňou vysporiadať na prvýkrát. Smer membrány a rotujúceho hriadeľa sa nastaví podľa pokynov (v prípade uhlovej rotačnej odstredivky je membrána kolmá na hriadeľ). Pri praktickom použití je rýchlosť vo všeobecnosti nižšia ako v príručke, čo môže predĺžiť životnosť odstredivého potrubia.
(4) Keď sa koncentruje na zvyšných 1 ml, vezmite 50ul tlmivý roztok a pridajte 10ul, aby ste pretiekli, aby ste zistili, či sa zmení na modrú, aby ste posúdili, či ultrafiltračná trubica uniká proteín. Ak trubica uniká, nalejte hornú vrstvu a prejdite cez novú trubicu a spustite ultrafiltráciu. Ak chcete presne posúdiť, či trubica uniká, odstreďte 5 mg ml BSA po dobu 10 minút, potom prejdite, spustite proteínové lepidlo alebo Bradford na hrubé meranie a pokračujte v pridávaní zostávajúceho proteínového roztoku na koncentráciu (pracujte na ľade, aby ste zabránili zahrievaniu proteínu), kým sa nepridajú všetky koncentrované roztoky. Venujte pozornosť tomu, či sa počas odstreďovania vyskytnú zrážky bielkovín, čo vedie k zablokovaniu potrubia. Ak dôjde k zrážkam, určite špecifickú príčinu zrážok, či je koncentrácia bielkovín príliš vysoká alebo tlmivý roztok nie je vhodný; Prvý môže byť vyriešený simultánnou ultrafiltráciou s viacerými ultrafiltračnými trubicami na zníženie koncentrácie. Druhým je výmena rôznych tlmivých roztokov, kým sa proteín nezrazí.
(5) Predchádzajúce kroky sa používajú na koncentráciu bielkovín. Ak chcete zmeniť tlmivý roztok, keď sa celkový proteínový roztok koncentruje na približne 1 ml, jemne pridajte nový tlmivý roztok (ultrafiltrácia cez ultrafiltračnú membránu 0,22um) a potom sa centrujte na približne 1 ml trikrát po sebe. Konečný objem poslednej koncentrácie závisí od požadovanej koncentrácie bielkovín, ktorá vo všeobecnosti nie je vyššia ako 500ul, alebo môže byť koncentrovaná na menej ako 200ul. Podľa objemovej koncentrácie najmenej 10-krát zakaždým môže dosiahnuť viac ako 1000 krát trikrát, čo môže v podstate dosiahnuť účel zmeny tlmivého roztoku.
