Štúdia o aplikácii hlbokej filtrácie vo výrobnom procese vakcíny proti slintačke a krívačke
Predslov - Čo je to slintačka a krívačka
V 14. storočí existujú písomné záznamy o podobnej slintačke a krívačke v Európe. Slintačka a krívačka je akútne, horúčkovité, vysoko nákazlivé ochorenie spôsobené vírusom slintačky a krívačky.
Klinické príznaky dospelých zvierat zahŕňajú: zvýšenú telesnú teplotu, pľuzgiere a vredy v ústach, pľuzgiere a vredy na kopytách a dokonca vypadávanie škrupiny kopyt, čo spôsobuje ťažkosti pri jedení a spánku, úbytok hmotnosti a dokonca aj stratu ekonomickej hodnoty u hospodárskych zvierat ;
Medzi klinické príznaky mladých zvierat patria: zvýšená telesná teplota, myokarditída a iné príznaky, po nástupe majú mladé zvieratá vysokú mortalitu.
Abstraktné
Za posledných 500 rokov sa na celom svete opakovane objavila slintačka a krívačka a veľké množstvo ošípaných, hovädzieho dobytka, oviec a iných domácich zvierat a voľne žijúcich párnokopytníkov uhynulo alebo ochorelo, čo vážne postihlo hospodárske zvieratá. a chovateľský priemysel.
Za účelom štúdia aplikácie technológie hĺbkovej filtrácie vo výrobnom procese vakcíny proti slintačke a krívačke sa testovala a porovnávala filtrovateľnosť povrchovej filtrácie a hĺbkovej filtrácie, ako aj ochranný účinok na baktericídnu filtráciu. Študovali sa výhody hĺbkovej filtrácie s vysokým nábojom pri odstraňovaní zvyškov buniek. Analyzovali sa zodpovedajúce filtračné schémy pre bunkové kultivačné médium s rôznym zákalom.
Výsledky ukázali, že hĺbková filtračná záťaž bola 13,9-krát väčšia ako pri povrchovej filtrácii, zákal filtračnej kvapaliny bol len 23,5 % povrchovej filtrácie a následná debakterializačná záťaž 0.2um bola 7,2-krát väčšia ako pri povrchovej filtrácii. povrchová filtrácia. Použitím špeciálneho živicového ligandu je zákal filtračnej kvapaliny 38,6 % zákalu bežného hlbokého filtra s rovnakou veľkosťou pórov, čo je prospešné na ochranu následného procesu. Výsledky ukázali, že hĺbková filtrácia, najmä hlboká filtrácia so silným pozitívnym nábojom, by sa mohla efektívne použiť na výrobu vakcíny proti FMD a pre rôzne kultivačné médiá by sa mali zaviesť vhodné filtračné procesy.
Slintačka a krívačka a hĺbková filtrácia
Slintačka a krívačka (FMD) je akútne, horúčkovité a nákazlivé ochorenie párnokopytníkov spôsobené vírusom slintačky a krívačky (FMDV). Medzi zvieratá najviac náchylné na túto chorobu patrí hovädzí dobytok, ošípané a ovce. Slintačka a krívačka je endemická v Ázii, Afrike, na Strednom východe a v Južnej Amerike s veľmi vysokým výskytom a rýchlym prenosom. Svetová organizácia pre zdravie zvierat (OIE) ju uvádza ako prvú zoonotickú chorobu kategórie A, ktorá vyžaduje, aby členské štáty zaradili slintačku a krívačku do zoznamu chorôb zvierat podliehajúcich hláseniu. Očkovanie je účinným prostriedkom špecifickej prevencie slintačky a krívačky. Inaktivovaná vakcína slintačky a krívačky, ktorá sa vyrába inaktiváciou intaktného vírusu inaktivátorom, zohráva dôležitú úlohu pri prevencii a kontrole slintačky a krívačky.
Antigenicita samotného FMDV je slabá a inaktivácia vírusu má veľký vplyv na jeho antigén. Preto pri súčasnej výrobe vakcíny slintačky a krívačky môže vysoko čistá vakcína slintačky a krívačky zabezpečiť obsah antigénu a čistotu jednotkovej dávky, čo je obzvlášť dôležité a je to aj súčasná vakcinačná stratégia. To kladie vysoké požiadavky na následné čistenie vírusov. Okrem toho pred rokom 2009 inaktivované vakcíny proti slintačke a krívačke v Číne väčšinou prijali kultivačný spôsob otáčania fľaše a prilepenia na stenu. S rastúcim dopytom po vakcínach sa postupne objavili nevýhody tejto kultivačnej metódy vyžadujúcej veľký počet rotujúcich fliaš, nízku účinnosť a nízku úroveň expresie.
Preto sa v posledných rokoch technológia bunkovej kultúry pomaly zmenila z predchádzajúcej adherentnej kultúry na suspenznú kultúru a produkcia vírusu sa výrazne zlepšila. So zvýšením produkcie vírusu však zmena kultivačného režimu priniesla väčší tlak na následné čistenie, pretože sa zodpovedajúcim spôsobom zvýšilo množstvo bunkového odpadu generovaného kultivačným procesom, uvoľňovanie hostiteľských proteínov, hostiteľskej DNA atď. kladie ďalšie požiadavky na schopnosť následného čistenia.
Technológia membránovej filtrácie je široko používaná vo výrobnom procese biologických produktov, ako sú vakcíny, medzi ktorými sa zvyčajne používa technológia DC filtrácie v procese zberu chorobného jedu na oddelenie nerozpustných nečistôt, ako sú bunkové zvyšky. V ranom objasňovaní FMDV bola hlavne prijatá technológia povrchovej filtrácie reprezentovaná skladacím membránovým filtračným prvkom. So zmenou podmienok kultivácie, nárastom nečistôt z bunkového odpadu, povrchovou filtráciou je ťažké dosiahnuť efekt čírenia, a pretože zaťaženie povrchovou filtráciou je nízke, náklady na filtračné materiály sú stále vyššie a vyššie.
Na základe vyššie uvedeného sa v procese separácie FMDV v cytokvapaline čoraz viac uplatňuje hĺbková filtrácia. Hlboký filtračný materiál sa zvyčajne skladá z dlhých a jemných vlákien z prírodných zdrojov a kanálik vytvorený filtračným médiom po vytvorení filmu je často veľmi kľukatý, podobne ako štruktúra labyrintovej apertúry. Častice nečistôt sú často zachytené vo vnútri filtra a nie na povrchu. Okrem toho stena filtračného kanála často absorbuje časť nečistôt extrémne jemných častíc elektrostatickým pôsobením alebo medzimolekulovou silou. Vo všeobecnosti je filtračný mechanizmus hĺbkovej filtrácie charakterizovaný mechanickou retenciou a adsorpciou.
Metóda filtrácie s konštantným prúdom
Nainštalujte hlbokú filtračnú dosku na filtračné zariadenie s konštantným prúdom, premyte filtračnú dosku pufrom PBS nad 54 l/m2; Po dokončení premývania spustite peristaltické čerpadlo, aby pomaly čerpalo kvapalinu, pomaly upravte rýchlosť čerpadla na očakávaný prietok a prefiltrujte kvapalinu. Zaznamenajte objem filtrácie, čas, rozdiel tlaku a zákal počas procesu filtrácie. Filtrát sa odobral na detekciu antigénu.
Výhody hĺbkovej filtrácie
Povrchová filtrácia je technológia, ktorá zachytáva častice na povrchu filtračného materiálu na dosiahnutie filtrácie. Mechanizmus filtrácie je založený hlavne na veľkosti častíc v fluidnom sitku, veľké častice sa zachytávajú na povrchu filtračnej membrány. Hĺbková filtrácia využíva vnútorné kanály na zachytávanie a adsorpciu častíc v hĺbke. Porovnávacia schéma oboch je znázornená na obrázku 1.
Inaktivovaný roztok vakcíny proti slintačke a krívačke od istého výrobcu bol vopred prefiltrovaný pomocou 0.45um polypropylénovej povrchovej membrány a hlbokou filtračnou doskou a potom filtrovaný 0.2um baktericídnym filtrom. Údaje o filtrovateľnosti sú uvedené v tabuľke 1.
Zákal inaktivovaného roztoku vakcíny proti slintačke a krívačke je 77 NTU. Ak sú baktérie filtrované priamo, veľké množstvo bunkových fragmentov nevyhnutne spôsobí rýchle zablokovanie filtračnej membrány 0.2um, čo ovplyvní prenos vičastíc 146S. Preto bola pred debakterializačnou filtráciou navrhnutá predfiltrácia a porovnávali sa dve predfiltračné metódy hĺbkovej filtrácie a povrchovej filtrácie. Dvojvrstvová hlboká filtračná doska je vybraná na filtráciu, zaťaženie je 641 l/m2 a hĺbkový filter redukuje materiál 77 NTU na 9,65 NTU, čo je číry a svetlý. Zaťaženie povrchovej filtrácie 0 0,45 um je len 46 l/m2 a zákal filtračnej kvapaliny je až 41 NTU, čo nie je vhodné na predfiltráciu. Podľa porovnania následného zaťaženia debakterializovanou filtráciou 0.2um je zaťaženie debakterializovanej filtračnej membrány po hĺbkovej filtrácii 655 l/m2, čo je 7,2-násobok zodpovedajúceho zaťaženia povrchovou filtráciou filtrácie (len 91 l/m2) .
Výsledky testov 146S ukazujú, že výťažok hĺbkového filtračného systému je vyšší ako výťažok povrchového filtračného systému. Zaťaženie hĺbkovou filtráciou bolo 13,9-krát väčšie ako pri povrchovej filtrácii, zákal filtračnej kvapaliny bol iba 23,5 % v porovnaní s povrchovou filtráciou a následná filtračná záťaž 0.2um baktérie odstraňovala 7,2-krát väčšia ako pri povrchovej filtrácii. povrchová filtrácia. Preto ako z hľadiska nákladov, tak aj z hľadiska výťažnosti je systém hĺbkovej filtrácie výrazne lepší ako systém povrchovej membránovej filtrácie.
Výhody hlbokého filtra so silným kladným nábojom
Hlboká filtračná doska s kladným nábojom a hlboká filtračná doska so silným kladným nábojom sa použili na porovnanie inaktivovaného roztoku vakcíny proti slintačke a krívačke z rôznych zdrojov. Výsledky filtrovateľnosti sú uvedené v tabuľke 2 a zmena rýchlosti filtrácie a rozdiel tlaku v procese filtrácie je znázornený na farebnom rozložení 2.
Dve skupiny použitých hlbokých filtračných dosiek majú rovnakú presnosť apertúry a výkon je veľmi konzistentný z hľadiska zmeny zaťaženia a tlakového rozdielu a krivka zmeny tlakového rozdielu na obrázku 2 je v podstate identická.
Rozdiel v zakalení filtračnej kvapaliny je však veľmi veľký. Filtračná kvapalina obyčajnej kladne nabitej dvojvrstvovej filtračnej platne je 25 NTU, zatiaľ čo filtračná kvapalina silne kladne nabitej hlbokej filtračnej platne s rovnakým otvorom je len 9,65 NTU, čo je len 38,6 % obyčajnej hlbokej filtračnej platne. Je to hlavne kvôli špeciálnemu živicovému ligandu v silnom kladnom náboji hlbokom filtračnom materiáli. Zákal je znížený na menej ako 10 NTU silne pozitívnou dvojvrstvovou filtračnou doskou a bunkové fragmenty sú plne adsorbované alebo zachytené, čo prispieva k následnému ultrafiltračnému alebo baktericídnemu filtračnému procesu. Okrem adsorpčného účinku na nerozpustné bunkové zvyšky Yigzaw Y et al. tiež opísali odstraňovací účinok silne kladne nabitej hlbokej filtračnej platne na bunkový hostiteľský proteín a Dorsey N et al ohlásili odstraňovací účinok silne kladne nabitej hlbokej filtračnej platne. na DNA.
Zavedenie procesu číriacej filtrácie pre supernatant vakcíny proti slintačke a krívačke hĺbkovou filtráciou
Prostredníctvom vyššie uvedenej porovnávacej štúdie povrchovej filtrácie a hlbokej filtrácie a štúdie objasňovacieho účinku špeciálnej silne pozitívne nabitej hlbokej filtračnej platne by sa mali rôzne filtračné schémy prispôsobiť inaktivovanému supernatantu vakcíny proti slintačke a krívačke vyrobenej za rôznych podmienok. podmienky kultúry. Pre supernatant z centrifugácie s 3 rôznymi zákalmi, nízkym zákalom, stredným zákalom a vysokým zákalom je schéma hlbokej filtrácie a zodpovedajúce parametre filtrácie uvedené v tabuľke 3.
V prípade odstredivého supernatantu s nízkym zákalom môže jednovrstvová hlboká filtračná doska účinne vyčistiť a odstrániť malé množstvo bunkových zvyškov. V prípade odstredivého supernatantu so stredným zákalom môže dvojvrstvová hlboká filtračná doska účinne objasniť, najmä hlboká filtračná doska so silným pozitívnym nábojom môže znížiť zákal na menej ako 5 NTU; Pre supernatant z centrifugácie s vyšším zákalom je možné kombinovanú filtračnú platňu účinne vyčíriť. Bez ohľadu na to, ktorý proces je, kapacita spracovania je 500 ~ 800 l/m2, zákal filtračnej kvapaliny je menší ako 20 NTU a cieľový antigén je úplne obnovený, vhodný na výrobu vo veľkom meradle.
Diskusia
V 70. rokoch 20. storočia bolo špecifikované, že filtračné médiá nepoužívajú azbestové materiály z dôvodu prítomnosti karcinogénov v azbestových materiáloch. Hĺbkový filtračný materiál neobsahuje azbest a má silnejší kladný náboj. Filtračný materiál je vyrobený z drevovláknitej matrice a filtračnej pomôcky. Vo výrobnom procese sa polymérová živica používa na spojenie základných komponentov a funkčné skupiny s kladným nábojom v ňom účinne poskytujú schopnosť adsorpcie náboja hlbokého filtračného materiálu. Vynikajúci výkon adsorpčnej hĺbkovej filtrácie na schopnosť zachytávať jemné častice je znázornený na obrázku 3.
V tomto experimente sa vybrali rôzne živicové zložky a rôzne presné materiály na hlboké filtre na objasnenie filtračného testu kultivačného roztoku FMDV a porovnávací test sa uskutočnil s povrchovou filtráciou. Výsledky ukázali, že hĺbková filtrácia bola vhodnejšia na odstránenie bunkového odpadu ako povrchová filtrácia, čo viedlo k následnej filtračnej jednotke s riadením mikrobiálnej záťaže (0.2um). Okrem toho porovnaním filtračného účinku silne kladne nabitej hlbokej filtračnej dosky a obyčajnej kladnej hlbokej filtračnej dosky, silne kladne nabitá filtračná doska vykazuje silnú schopnosť regulovať zákal, čo môže znížiť zákal na menej ako 5 NTU, čo veľmi prispieva k zlepšeniu robustnosti celého filtračného procesu.
Upstream kultivačný proces má veľký vplyv na kroky zberu aktívnych zložiek. Prostredníctvom testovania tento experiment konečne vytvoril škálovateľnú filtračnú schému pre bunkové kultivačné médiá s rôznym zákalom, čo má určitý vodiaci význam pre produkciu vo veľkom meradle.
Hĺbkový filter, ktorý má byť uvedený na trh spoločnosťou Guidling Technology, je filtračný prvok diskového typu, čo je druh účinného filtračného prvku s hlbokou filtračnou lepenkou ako filtračným materiálom, ktorý plne spĺňa regulačné požiadavky biofarmaceutických výrobkov, navrhnutý a vyrobený špeciálne na odstraňovanie veľké pevné obsahy, ako sú bunky a bunkové fragmenty, a môžu byť aplikované na tekutinu z bunkovej kultúry cicavcov; Čírenie lyzátu baktérií a kvasinkových buniek; Odstránenie proteínu hostiteľskej bunky (HCP); Odstráňte vírus a DN; Odstránenie endotoxínov; Odstránenie odpeňovača.
Produkt má výhody malého mŕtveho objemu, lineárneho zosilnenia, štruktúry diskovej kapsuly, kompaktného dizajnu a môže byť použitý v sérii s iným zariadením, malým pôdorysom, stabilným prietokom, dlhou životnosťou a nízkymi nákladmi.