Aplikácia ultrafiltrácie pri výrobe ľudskej vakcíny proti besnote

Aby sa podporila aplikácia ultrafiltrácie pri výrobe vakcíny proti ľudskej besnote, použila sa 300 kDa ultrafiltračná membránová kazeta na koncentrovanie roztoku na zber vírusu besnoty a detekciu obnovy antigénu, rýchlosti odstraňovania endotoxínu a rýchlosti odstraňovania hostiteľského proteínu po ultrafiltrácii. Výsledky ukázali, že pod vhodným tlakom sa zberný roztok vírusu besnoty skoncentroval 80-krát, eluoval 25-krát, miera obnovy antigénu bola 86,2 %, miera odstránenia bakteriálneho endotoxínu bola 87,5 % ~ 88,7 % a miera odstránenia hostiteľského proteínu bola 91,6 %.

 

Predslov

 

Besnota je tradičné, staré zoonotické ochorenie spôsobené vírusom besnoty (RV), s úmrtnosťou až 100 %. V súčasnosti neexistuje iná účinná liečba postexpozície (t. j. poškodenia kože a slizníc) ako núdzová vakcína a očkovanie imunoglobulínmi. Hlavným zdrojom besnoty u ľudí je uhryznutie od chorých alebo potenciálne infikovaných zvierat (hlavne psov). Úmrtnosť na besnotu je v Číne na druhom mieste na svete a besnota je jedným z problémov ohrozujúcich bezpečnosť verejného zdravia u nás. Kapsulárny glykoproteín vírusu besnoty, ktorý je jediným kľúčovým antigénom, ktorý indukuje tvorbu ochrannej neutralizačnej protilátky, bol stredobodom výskumu a vývoja nových vakcín a nových technológií diagnostiky a liečby vírusu besnoty.

 

Vírus besnoty patrí do rodu vírusov besnoty z čeľade rabdovírusov. Tvar nukleokapsidu je elastický, nukleokapsid je špirálovito symetrický a povrch má obal obsahujúci jednovláknovú RNA. Je to patogén, ktorý spôsobuje besnotu. Vírus besnoty má dva hlavné antigény: jeden je glykoproteínový antigén na vonkajšej membráne vírusu, ktorý sa môže viazať na acetylcholínový receptor, aby bol vírus neurotoxický, a produkovať neutralizačné protilátky a protilátky inhibujúce hemaglutináciu v tele, a neutralizačné protilátky majú ochranný účinok; Druhým je vnútorný riboproteínový antigén, ktorý môže spôsobiť, že telo produkuje protilátky viažuce komplement a precipitín, a nemá žiadny ochranný účinok.

 

Endotoxín je druh lipopolysacharidovej látky (LPS), ktorá má tepelnú odolnosť a chemickú stabilitu a nie je ľahké ju zničiť. Ak je vo vakcíne určitá koncentrácia endotoxínu, spôsobí po očkovaní silnú horúčku a dokonca smrť, preto by sa obsah endotoxínu vo vakcíne mal čo najviac znížiť. Vydanie Čínskeho liekopisu z roku 2005 (časť III) stanovilo, že kontrolná hodnota kvalifikovaného indexu endotoxínu vakcíny proti besnote by nemala byť vyššia ako 100 EU/dávka. S rýchlym vývojom technológie membránovej separácie sa vo farmaceutickom priemysle stále viac a viac rozširuje aplikácia technológie ultrafiltračnej membránovej separácie na zníženie obsahu endotoxínu vo vakcínach.

 

Vakcína proti besnote je vakcína proti besnote. Zvyčajne existujú tri typy vakcín proti besnote, vrátane vakcíny s purifikovanými bunkami Vero, vakcíny s ľudskými diploidnými bunkami a vakcíny z primárnej bunkovej kultúry. Vakcína proti besnote sa vyrába naočkovaním vírusu fixovaného vírusom besnoty do bunkovej matrice po kultivácii, zbere, koncentrácii, inaktivácii, purifikácii a pridaní vhodného stabilizátora. Hlavnou funkciou vakcíny proti besnote je stimulovať telo k rýchlej imunitnej odpovedi a produkcii ochranných protilátok proti vírusu besnoty, aby sa zabránilo infekcii spôsobenej vírusom a znížilo sa riziko ochorenia.

 

 

Výrobný proces vakcíny zohráva dôležitú úlohu pri zabezpečovaní kvality vakcíny, dôležitejšia je najmä kvantifikácia niektorých ukazovateľov vo výrobnom procese. Vo výrobnom procese ľudskej vakcíny proti besnote je technológia ultrafiltračnej koncentrácie nevyhnutným prostriedkom na výrobu ľudskej vakcíny proti besnote. Použitie ultrafiltračnej membrány s primeranou apertúrou na ultrafiltračnú koncentráciu môže účinne odstrániť endotoxín a hostiteľský proteín a zachovať RV antigén, čo prispieva k výrobe vakcíny a zlepšeniu kvality. Relatívna molekulová hmotnosť molekúl RV je 350 kDa ~ 460 kDa a teoreticky môže byť RV úplne zachytená ultrafiltračnou koncentráciou pomocou membránovej kazety s molekulovou hmotnosťou 100 kDa a 300 kDa. Endotoxín často tvorí agregovanú štruktúru v rôznych vodných roztokoch, kvôli stupňu agregácie je veľkosť molekúl odlišná. Relatívna molekulová hmotnosť endotoxínového monoméru je 10 kDa ~ 20 kDa a relatívna molekulová hmotnosť jeho polymerizačnej formy je 300 kDa ~ 1 000 kDa alebo viac ako 1 000 kDa. Na základe rozdielu v molekulovej hmotnosti bol RV antigén v ľudskej vakcíne proti besnote zadržaný a endotoxín a hostiteľský proteín v ľudskej vakcíne proti besnote boli odstránené 300 kDa ultrafiltračnou membránou.

 

V tomto experimente sa ultrafiltračná membránová kazeta s otvorom 300kDa a plochou membrány 0,11 m2 použila ako ošetrenie malej vzorky na koncentrovanie medziproduktov ľudskej vakcíny proti besnote a membránový tok, účinnosť liečby, násobok koncentrácie, zachytávanie antigénu, odstránenie endotoxínu a testovalo sa odstránenie hostiteľského proteínu.

 

2Materiálová metóda

 

2.1 Experimentálne materiály

kmeň CTN-IV fixovaný vírusom besnoty; Vero bunky; 0,5M hydroxid sodný; 300kDa ultrafiltračná membránová kazeta (materiál PES, plocha membrány 0,11 m²).

 

2.2 Experimentálne metódy

2.2.1 Príprava roztoku na zber vírusov

Zmrazené Vero bunky sa resuscitovali v teplej vode pri 37 °C ~ 39 °C, bunková suspenzia sa odsala a potom sa pridala do 199 kultivačného média obsahujúceho 10% inaktivovaného teľacieho séra. Jednotné jednovrstvové bunky sa kultivovali pri 37 stupňoch. Kmeň CTN-IV bol naočkovaný vírusom besnoty v pomere 0,1 mol/l a kultivovaný pri 37 stupňoch . Po 48 hodinách sa kultivačné médium vyhodilo a pridalo sa 199 kultivačného média obsahujúceho 0,1 % ľudského krvného albumínu, aby sa kultúra udržala pri 33 až 35 stupňoch. Zbierajte jed choroby raz za 3-5d a kombinujte viaceré zberové tekutiny.

 

2.2.2 Inštalácia membránovej kazety

Nainštalujte membránovú kazetu a zapojte zapojenie, ako je znázornené na obrázku nižšie.

 

2.2.3 Umývanie vodou

Zatvorte vstupný ventil, spätný ventil a priechodný ventil a vložte spätný koniec a cez koncové potrubie do nádrže na odpadovú kvapalinu. Naplňte saciu nádrž 1 l vody na injekciu.

Otvorte vstupné a spätné ventily, zatvorte priechodné ventily, otvorte čerpadlo, vyčistite spätné potrubie 10% objemom čistenej vody alebo vody na vstrekovanie a udržiavajte vstupný tlak na 0,35 baru (5 psi).

Otvorte ventil filtra, zatvorte spätný ventil a použite zvyšnú vstrekovaciu vodu na čistenie potrubia filtra, pričom udržujte TMP na 0 0,35 barov.

 

2.2.4 Dezinfekcia

Zatvorte vstupný ventil, spätný ventil a prevodový ventil a vložte spätný koniec a koncové potrubie prevodovky do nádrže na odpadovú kvapalinu. Naplňte saciu nádrž 2 l čistiaceho roztoku.

Otvorte vstupný a spätný ventil, zatvorte priechodné ventily, otvorte čerpadlo, vyčistite spätné potrubie 200ml 0,5M hydroxidu sodného a udržiavajte vstupný tlak na 0,35 bar (5 psi) .

Otvorte priechodný ventil, zatvorte spätný ventil a vyčistite priechodné potrubie 200 ml čistiaceho roztoku, pričom udržujte TMP na 0,35 baru.

Potom sa spätný koniec a priechodná koncová rúrka vložia do nádrže na kvapalinu na cyklické čistenie. Cyklujte čistenie s 1 až 1,5-násobkom procesného tangenciálneho prietoku po dobu 30 minút.

Vypustite 0,5 M hydroxid sodný a opláchnite vodou na injekciu podľa 2.2.4, kým nebude neutrálna.

 

2.2.5 Skúška vodného toku

Pridajte vyčistenú vodu do sacej nádrže, zmerajte a zaznamenajte teplotu vody v sacej nádrži. Vložte spätný koniec do nádrže. Spustite čerpadlo a upravte rýchlosť čerpadla a spätný ventil tak, aby ste dosiahli 0,35 bar (5 psi) rozdiel tlaku cez membránu. Pomocou valca zmerajte a zaznamenajte prietok na konci v ml/min. Nastavte rýchlosť čerpadla a spätný ventil tak, aby ste dosiahli rozdielový tlak cez membránu 1 bar (15 psi). Pomocou valca zmerajte a zaznamenajte prietok na konci v ml/min.

Ak chcete štandardizovať hodnotu prietoku vody, vydeľte vypočítanú hodnotu prietoku vody rozdielom transmembránového tlaku a vynásobte korekčný faktor teploty v nasledujúcej tabuľke.

 

2.2.6 Ultrafiltračná koncentrácia

Vymyte vodu zo systému pomocou vrchnej časti pufra. Cyklujte 5 minút, aby ste upravili pH a iónovú stabilitu systému. Ak je potrebné upraviť teplotu, pokračujte v cykle, kým nebude teplota systému stabilná.

Pridajte prívodnú kvapalinu do sacej nádrže, nastavte prietok (napr. 400 LMH) a otestujte prietok pri rôznych hodnotách TMP. Podľa testovacích údajov boli krivky nakreslené s TMP ako os a Flux ako ordináta.

Nasmerujte priechodnú rúrku do vhodnej nádoby alebo odtoku, ako sú zberné nádrže na konci, nádrže na odpadovú kvapalinu a procesné odtoky.

Zaznamenajte počiatočnú hmotnosť napájacej kvapaliny v napájacej nádrži, spustite napájacie čerpadlo a pomaly cirkulujte napájaciu kvapalinu počas 3 minút až 4 minút. Recirkulácia môže pomôcť odstrániť zvyškový vzduch v dráhe prúdenia, čím sa maximalizuje výkon fólie.

Otvorte priechodný ventil, pomaly zvyšujte rýchlosť čerpadla, kým sa nedosiahne optimálny tangenciálny prietok, a nastavte spätný ventil tak, aby ste dosiahli optimálnu TMP systému.

Potom vložte skúmavku do zbernej nádoby, začnite merať čas, keď kvapalina vstúpi do nádoby, a zaznamenajte vstupný a spätný tlak vo vhodných intervaloch a zaznamenajte kvalitu kvapaliny v priebehu času na vratnom konci a na priechode, aby ste vypočítali okamžitý prietok.

Ultrafiltračná koncentrácia vzorky je dokončená, keď sa objem kvapaliny v nástreku zníži na objem cieľovej koncentrácie.

 

2.2.7 Dialýza

Vložte sacie potrubie, doplňovacie potrubie a spätné potrubie do nasávacej nádrže, prenosové potrubie vložte do zbernej nádoby a zbernú nádobu položte na váhu, aby sa vyčistila.

Otvorte spätný ventil, spustite vstupné čerpadlo, otvorte priechodný ventil, nastavte rýchlosť čerpadla a TMP na príslušnú hodnotu. Otvorte doplňovacie čerpadlo, ponechajte objem kvapaliny v nasávacej nádrži nezmenený a spustite rovnoobjemovú dialýzu. Začnite merať čas, keď kvapalina vstúpi do nádoby, a zaznamenajte tlak na vstupnom konci, spiatočnom konci a hmotnosť kvapaliny vo vhodnom časovom intervale a vypočítajte okamžitý prietok.

 

2.2.8 CIP

Najprv opláchnite pufrom, potom opláchnite vodou na injekciu (operácia 2.2.3), potom vyčistite čistiacim prostriedkom (operácia 2.2.4) a nakoniec opláchnite vodou na injekciu (operácia 2.2.3).

 

2.2.9 Skúška toku vody

Postup je takýto: 2.4.5.

 

2.2.10 Konzervácia membránovej kazety

Krátkodobé skladovanie (menej ako 3 dni alebo rovné 3), ponechajte membránovú kazetu v prípravku a použite skladovací roztok na cyklovanie 10 minút až 15 minút, zatvorte ventil systému, vypnite napájanie čerpadla kvapaliny a zaistite či je nádrž na prívod kvapaliny správne utesnená.

Ak je doba skladovania 3 dni až 1 mesiac, vyberte membránovú kazetu z prípravku a uzavrite ju do plastového vrecka alebo inej vzduchotesnej nádoby. Pridajte asi 50 ml až 100 ml skladovacieho roztoku do plastového vrecka alebo vzduchotesnej nádoby a uzavrite. Alebo môže byť ponorený priamo do úložného roztoku. Nasledujúca tabuľka odporúča podmienky skladovania.

 

3 Výsledky a analýza

 

3.1 Skúmanie faktorov ovplyvňujúcich účinnosť odstraňovania pyrogénov

Prevádzkový tlak ultrafiltrácie: Nepretržite prebiehalo 15 testovacích dávok. V každej dávke sa počas ultrafiltrácie filtračný tlak udržiaval na 5, 10, 15 a 2{{10}}} psi a kvapalina na zber vírusu sa 30-krát skoncentrovala a eluovala sa kvapalinou pufra (10-násobok objemu) v nepretržitom toku. Výsledky uvedené v tabuľke nižšie, rýchlosť odstraňovania endotoxínu bola nižšia ako 87,0 %, rýchlosť obnovy antigénu bola stabilná na 86,0 % a rýchlosť odstraňovania hostiteľského proteínu bola stabilná na 90,0 %, čo naznačuje že rôzne prevádzkové tlaky mali malý vplyv na účinok regenerácie antigénu, odstraňovania endotoxínu a odstraňovania hostiteľského proteínu.

Pomer ultrafiltračných koncentrácií: 15 testovacích šarží prebiehalo nepretržite. V každej dávke sa kvapalina na zber vírusu počas ultrafiltrácie skoncentrovala 30-krát, 50-krát, 80-krát a 100-krát v tomto poradí. Filtračný tlak sa udržiaval na 20 psi a kvapalina pufra (10-násobok objemu) sa eluovala kontinuálnym prietokom. Výsledky, ako sú uvedené v nasledujúcej tabuľke, miera odstraňovania endotoxínu sa pohybovala od 53,3 % do 86,9 %, miera obnovy antigénu zostala stabilná na 86,0 % a miera odstraňovania hostiteľského proteínu bola stabilná na 91,0 %. Pri segmentovanom odbere vzoriek sa v transmisnom roztoku nezistil žiadny antigén a v koncentrovanom vírusovom roztoku zostalo menej ako 10 % hostiteľského proteínu. Koncentrácia endotoxínu v koncentrovanom roztoku vírusu sa zvyšovala so zvyšovaním časov koncentrácie a rýchlosť odstraňovania endotoxínu bola najvyššia v koncentrovanej vzorke 80-krát a výrobca mohol uvažovať aj o koncentrácii 100-krát, čo nielen zlepšila efektívnosť výroby a znížila náklady, ale splnila aj požiadavky na výrobu vakcín.

 

3.2 Vyčerpanie toku membránovej kazety a regenerácia čistenia

Po ošetrení bola miera regenerácie membránového toku 92,6 %. Prvá rýchlosť obnovy novej membránovej kazety je normálna, podľa aktuálnych pozorovacích vlastností privádzanej kvapaliny, následnej predpovede druhého a NTH časov, rýchlosť obnovy toku membránovej kazety bude po tomto spracovaní blízka údajom a bývajú stabilné. Do 2 hodín po jednom použití bolo vyčerpanie membránovej kazety ideálne a počas celkovej prevádzky sa vyčerpalo iba 10 % membránového toku.

3.2.1 Deplécia toku v procese spracovania membránovej kazety

3.2.2 Výsledok čistenia a regenerácie membránovej kazety

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je národný high-tech podnik so zameraním na biofarmaceutiká, bunkovú kultúru, čistenie a koncentráciu biomedicíny, diagnostiky a priemyselných tekutín. Úspešne sme vyvinuli odstredivé filtračné zariadenia, ultrafiltračné a mikrofiltračné kazety, vírusový filter, TFF systém, hĺbkový filter, duté vlákno atď., ktoré plne spĺňajú aplikačné scenáre biofarmaceutík, bunkových kultúr atď. Naše membrány a membránové filtre sú široko používané pri koncentrácii, extrakcii a separácii predfiltrácie, mikrofiltrácie, ultrafiltrácie a nanofiltrácie. Naše mnohé produktové rady, od malých jednorazových laboratórnych filtrácií až po výrobné filtračné systémy, testovanie sterility, fermentáciu, bunkové kultúry a ďalšie, spĺňajú potreby testovania a výroby. Guidling Technology sa teší na spoluprácu s vami!