Zhrnutie:

Tento článok skúma dva kľúčové faktory, ktoré sa musia brať do úvahy v stratégiách čistenia proteínov: požiadavky na aplikáciu po prúde a biologické charakteristiky samotných proteínov. Článok zdôrazňuje, že vysokokvalitné čistenie proteínov je základom spoľahlivosti a opakovateľnosti experimentálnych údajov, najmä na výrobu rekombinantných proteínov. Rôzne scenáre aplikácií majú špecifické požiadavky na čistotu proteínov, aktivitu alebo obsah endotoxínu a charakteristiky proteínov môžu významne ovplyvniť stratégie čistenia. Podľa konkrétnych prípadov článok ilustruje, že jedinečné proteíny by mali prijať prispôsobené čistiace schémy. Nakoniec bol navrhnutý systematický proces výroby proteínov (obrázok 1), ktorý zdôraznil kontrolu kvality úplného procesu z výberu expresných systémov, návrh konštrukcie na optimalizáciu čistenia a odporúčanie hodnotenia proteínovej homogenity a funkčnosti prostredníctvom biofyzikálnych techník (ako napríklad SEC-MAL atď.). Cieľom tohto článku je poskytnúť výskumným pracovníkom praktické usmernenie, čím im pomáha formulovať efektívne a opakovateľné stratégie čistenia založené na charakteristikách a požiadavkách na aplikáciu cieľových proteínov, čím sa zvyšuje kvalita a efektívnosť vedeckého výskumu.

 

Obrázok 1. Schematický diagram procesu výroby proteínov

 

Výroba proteínov s vysokým dopytom - príklady identifikácie problémov, návrh stratégie zmierňovania a zodpovedajúci výstup

 

1. Viazanie kyseliny nukleovej na proteín:

Pri čistení proteínov viažucich na nukleovú kyselinu je potrebné na odstránenie kontaminácie nukleových kyselín viac krokov. Počas lýzy sa musia pridať nukleázy (ako napríklad Nukleáza SM (benzonase®) alebo DNáza alebo RNáza), ale viazané nukleové kyseliny sa nedajú úplne odstrániť. Nahraďte kroky odstraňovania nukleových kyselín, ako je zrážanie sulfátu sulfátu PEI alebo streptomycín, čistenie heparínu alebo chromatografia výmeny iónov. Prítomnosť nukleových kyselín bola monitorovaná pomerom A26 0 nm/a28 0 nm počas procesu čistenia. Ak bol pomer nižší ako 0,6, naznačuje, že čistota proteínu bola relatívne vysoká a kontaminácia nukleových kyselín bola minimálna. Pre proteíny so silne viazanými nukleovými kyselinami môžu byť dočasne denaturované (napríklad ošetrené močovinou) a potom renaturované. Kľúčové body: Používajte vysoko kvalitné činidlá, čerstvé vyrovnávacie pamäte a čisté stĺpce (pred použitím čistite s 0,5 m NaOH).

 

2. Mouse Ferritin Heavy Chain:

Účelom produkcie purifikovaného myšieho feritínového ťažkého reťazca (MFTH1) proteín je kryoelektrónová mikroskopia s jednou časťou s vysokým rozlíšením (Cryo-EM). Expresný vektor Escherichia coli kódovaný neznačeným MFTH1 bol ultrazvukne narušený bez pridania akejkoľvek nukleázy. Po zahriatí v stupni 7 0 podstúpila kroky zrážania síranu amónneho, dialýzy a chromatografie vylúčenia veľkosti. Výsledná vzorka ukázala prítomnosť veľkého množstva kontaminantov v obrazoch kryo-elektrónovej mikroskopie (obrázok 2A), ktorá bola pre jeho aplikáciu úplne nevhodná. Optimalizujte kroky. Pridajte SM nukleázu počas procesu lýzy bunky a proces dialýzy po zrážaní sulfátu amónneho a potom pridajte krok výmeny aniónov, aby sa znížil pomer A26 0 nm/a280nm z 1,4 do 0,8. Po chromatografii na vylúčenie veľkosti bol pomer A260NM/A280NM konečnej vzorky MFTH1 0,56. Obrázky SDS-PAGE a kryoelektrónové mikroskopie (obrázok 2B) ukázali, že proteín bol veľmi čistý, čo naznačuje, že kontaminanty boli účinne odstránené.

Obrázok 2 ťažký reťazec feritínu myši

 

 

 

3. Chimérický proteín ľudský DSRBEC (DSRBD-EGF-Chimera):

DSRBEC sa tvorí fúziou dvojvláknovej RNA väzbovej domény (DSRBD) ľudskej proteínkinázy R a ľudským epidermálnym rastovým faktorom (HEGF). Keď je DSRBD exprimovaný v Escherichia coli, vykazuje mimoriadne vysokú väzbovú schopnosť dsRNA. Po lýze buniek kontaminentná RNA brzdí väzbu rekombinantných proteínov na stĺpec s afinitnou chromatografiou s fixnou kovovou iónmi (IMAC). Konvenčné metódy, ako sú zrážanie sulfátu sulfátu PEI alebo streptomycín, ošetrenie RNázy alebo roztoky s vysokým obsahom tlmivého roztoku, nemôžu odstrániť RNA. Bunková lýza sa uskutočňovala s použitím pufra obsahujúceho 4m močovinu. Supernatant bol načítaný do stĺpca IMAC a močovina 4 m do {4}} m sa pomaly používala cez noc (renaturácia stĺpca). Renaturačná pufor bola pridaná s imidazolom a eluovaná zo stĺpca IMAC. Konečné vylepšenie sa uskutočnilo prostredníctvom gélovej filtrácie Superdex 75, aby sa získala funkčne aktívny DSRBEC.

 

4. Proteíny viazané na dvojmocné katióny alebo iné kofaktory:

Pre proteíny, ktoré interagujú s dvojmocnými katiónmi, ako sú Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+ alebo iné kofaktory, je rozhodujúce pridať špecifické dvojmocné katióny (alebo iné kofaktory) počas expresie. Počas procesu čistenia sa vyžaduje aj malé množstvo rovnakých dvojmocných katiónov (alebo iných kofaktorov). Musí sa však vyhnúť používaniu akýchkoľvek chelatačných činidiel (ako je EDTA, EGTA) a cheláty redukčných látok (napríklad DTT alebo DTE). Pri riešení proteínov viazaných na dvojmocné katióny sa musí na potvrdenie skutočnej prítomnosti dvojmocných katiónov (alebo iných kofaktorov) v purifikovanom proteíne pomocou spektroskopických metód (ako napríklad atómová absorpčná spektrofotometria (ako napríklad atómová absorpčná spektrofotometria).

 

5. Rekombinantný ferridoxín (RFD) obsahujúci jeden klaster [2FE ± 2S] z termofilných cyanobaktérií mastigocladus laminosus

Ferridoxín je rozpustný proteín železa-síra, ktorý sa podieľa na reakciách prenosu elektrónov. Ferredoxín typu rastlín nesie jeden kmeň [2Fe ± 2S] ako elektrónový akceptor fotosystému I. Escherichia coli BL21 (DE3) kmeň exprimoval rekombinantný RFD proteín v TB médiu obsahujúceho 10 mm FECL3 a antibiotiká. Elúcia kolóny zachytávania IMAC sa uskutočňovala s použitím pufra obsahujúceho 10 mm histidín, aby sa zabránilo imidazolu a zabránilo deštrukcii klastru [2FE ± 2S]. Chromatografia na výmenu aniónov a veľkosti sa použila na ďalšie čistenie a koncentráciu na 12 mg/ml na skríning kryštalizácie. V porovnaní s rekombinantnou produkciou ferredoxínu sa prírodný ferredoxín purifikoval z modro-zelených rias mastigocladus laminosus počas kryštalizácie vyššie rozlíšenie.

 

6. Proteíny používané ako antigény

Proteíny sa často používajú ako antigény na obnovenie cieľových ligandov. Prvá vec, ktorú je potrebné zvážiť, je, či sa proteín používa na imunitu in vivo na získanie konvenčných monoklonálnych alebo polyklonálnych IgG alebo na programy zahŕňajúce procesy výberu Camel IgG alebo in vitro.

 

6.1 Antigény používané na rutinnú produkciu protilátok

Ak sa antigény používajú na produkciu monoklonálnych protilátok IgG, správne skladanie antigénu nie je zvyčajne potrebné, pretože väčšina monoklonálnych protilátok rozpoznáva lineárne epitopy, ktoré nie sú výrazne ovplyvnené štruktúrou antigénu a dokonca aj denaturovaných antigénov (ako sú napríklad inklúzne telesné proteíny). Čistota sa však musí prísne kontrolovať, aby sa zabránilo silným imunogénnym kontaminantom, ktoré narúšajú imunitnú reakciu a spôsobujú dominanciu necieľových protilátok.

 

6.2 Skríning konjugovanej knižnice

Osobitná pozornosť by sa mala venovať udržiavaniu prirodzenej konformácie antigénu počas spracovania knižnice nanobody získanej imunizáciou ťavov. Na rozdiel od konvenčných protilátok majú Camel protilátky (najmä nanobody) tendenciu rozpoznávať štrukturálne epitopy, ktoré súvisia s ich jedinečnou konvexnou komplementárnou štruktúrou miesta. Podobne, pri skríningu veľkých syntetických alebo prírodných knižníc protilátok in vitro musí antigén udržiavať štruktúru, ktorá je úplne konzistentná s cieľovou aplikáciou. Pretože samotný skríningový proces je nezasiahnutý, ak antigén nesprávne zložila, agregačnú alebo konformačnú heterogenitu, môže sa skrínovať veľké množstvo konjugátov zameraných na prírodné epitopy.

 

 

 

7. Proteíny obsahujúce intermolekulárne alebo intramolekulárne disulfidové väzby alebo voľný cysteín

Disulfidové väzby sú rozhodujúce pre stabilizáciu prirodzenej štruktúry proteínov. Počas čistenia, pri čistení proteínov obsahujúcich intermolekulárne alebo intramolekulárne disulfidové väzby, je potrebné vyhnúť sa pridaniu redukčných činidiel, aby sa zabránilo konformačným zmenám proteínov, čím sa zmení ich funkcie. Pre proteíny obsahujúce voľný cysteín sú redukčné činidlá nevyhnutné vo všetkých krokoch procesu čistenia, najmä počas skladovania, aby sa zabránilo tvorbe umelých disulfidových väzieb. Najbežnejšie používané redukčné činidlá sú ditiotreitol (dtt), -mercaptoetanol (-me) a Tris ({2- karboxyetyl) fosfín hydrochlorid (Tcep). V prípade IMAC živíc, ktoré sú nekompatibilné s DTT alebo TCEP, sa odporúča použiť -Me a nahradiť ich inými redukčnými činidlami v nasledujúcich krokoch.

 

8. Fragment rekombinantnej protilátky

Aj keď štruktúra fragmentov rekombinantných protilátok (ako napríklad nanobody) je jednoduchšia ako štruktúra IgG, ich funkcia závisí od správnej tvorby disulfidových väzieb. V bakteriálnych expresných systémoch sa stále môžu vyskytnúť nesprávne zložené alebo čiastočne zložené produkty, ktoré existujú v rozpustnej časti aj v inklúzii. Viac skryté je, že dokonca aj správne zložené fragmenty protilátok môžu tvoriť rozpustné agregáty (koloidná agregácia) prostredníctvom hydrofóbnych plakov na povrchu. Takéto agregáty je ťažké identifikovať v rutinných funkčných testoch (ako je ELISA), pretože multivalentná väzba môže maskovať pokles afinity monomérov, ale ich prítomnosť môže vážne ovplyvniť aplikácie, ktoré sa spoliehajú na veľkosť malých molekúl (ako je mikroskopia super rozlíšenia). Preto spoliehanie sa výlučne na SDS-PAGE nie je dostatočné na vyhodnotenie kvality vzorky. Biofyzikálne metódy, ako je gélová filtrácia (obrázok 3), sa musia prijať na rozlíšenie monomérov (hlavné vrcholy) od agregátov (vrcholy objemu vylúčenia). Kľúčové kontrolné body zahŕňajú: optimalizáciu redoxného prostredia počas expresie na podporu tvorby disulfidov väzby a optimalizácia podmienok skladovania po čistení, aby sa zabránilo agregácii. Tieto opatrenia sú rozhodujúce pre zabezpečenie monodisperzity a funkcie fragmentov protilátok.

Obrázok 3. Separácia gélovej filtrácie rozpustných agregátov nanobodí

 

9. Rozpustné fragmenty lymfocytového receptora LLT1

Rekombinantná expresia proteínov závislých od disulfidovej väzby (ako je receptor lymfocytov LLT1) často čelí problémom so skladaním. Gélová filtrácia LLT1 divokého typu vykazovala agregačné píky a dimérové ​​píky (obrázok 4A), ale hmotnostná spektrometria odhalila nesprávne zloženie spôsobené nepárovým cysteínom v diméri (obrázok 4B). Na tento účel boli navrhnuté dva mutanty: jeden odstránil problém cysteín, čo malo za následok náhly pokles výťažku (obrázok 4A); Po zavedení neocysteínu na rekonštrukciu prispôsobenej disulfidovej väzby mal mutant nielen vysoký výťažok a dobrú stabilitu, ale mohol tiež kryštalizovať (obrázok 4C) a 3D štruktúra potvrdila, že mutant tvoril správnu disulfidovú väzbu a udržiaval prirodzené skladanie. Tento prípad demonštruje, že racionálnym navrhovaním konformných disulfidových väzieb v kombinácii s gélovou filtráciou a analýzou hmotnostnej spektrometrie je možné efektívne vyriešiť problém so skladaním rekombinantných proteínov a je možné získať funkčné proteíny so stabilnými štruktúrami a vysoké výťažky.

Obrázok 4. Rekonštrukcia disulfidovej väzby zlepšuje skladanie a výťažok rozpustného LLT1

 

 

 

10. Ľahko agregovateľné proteíny

Čistenie rekombinantných proteínov často čelí problému agregácie a jeho tvorba sleduje mechanizmus „nukleačný rast“-najprv sa tvorí malé množstvo rozpustných agregátov a potom spustí rozsiahlu nerozpustnú agregáciu. Na vyriešenie tejto výzvy je potrebné prijať viacúrovňové stratégie: v štádiu expresie sa to dá dosiahnuť optimalizáciou kmeňa, znížením teploty kultúry, používaním modifikovaného kultivačného média alebo rôznych solubilizačných fúznych proteínov a nahradením expresných systémov (hmyz/bunky cicavcov) atď. SEC) by sa malo prijať na okamžité odstránenie agregovaných jadier. Všeobecne povedané, pri skríningových roztokoch pufra by sa mali brať do úvahy faktory, ako je zloženie komponentov, hodnota pH, disociačné činidlo alebo solubilizátor (obrázok 5). Prostredníctvom jemnej optimalizácie ortogonálnej detekcie (ako je SEC, CD, LS, DSF a teplota na základe fluorescenčného tepla atď.) Boli stanovené kvalita proteínu a najvhodnejší roztok pufra.

Obrázok 5. Stratégie na zmiernenie agregácie proteínov

 

11. Kryštalizácia ľudskej kinázy Clk1 (ako získať reprodukovateľné dávky)

Na získanie homogénnej nefosforylovanej CLK1 kinázy pre štúdie kryštalizácie sa prijal multi-strategická kolaboratívna schéma. Po prvé, bola spolu s A -fosfatázou v Escherichia coli koexprimovaná, aby sa eliminovala heterogenita autofosforylácie. Aj keď sa výťažok znížil, bola zabezpečená úplná defosforylácia. Po zachytení IMAC bol Eluent doplnený stabilizátormi (50 mm arginín, 50 mm kyselina glutámová a 10 mm DTT), aby sa zabránilo agregácii, koncentrovanej a jeho značka bola odstránená štiepením TEV. Potom bol správny oligomér oddelený SEC (obsahujúci 5% glycerol a -me). Konečný rozhodujúci krok výmeny aniónov rozlišuje medzi kryštalickými (nefosforylovanými) a nekryštalickými (čiastočne fosforylovanými) skupinami CLK1. Obzvlášť stojí za zmienku, že spôsob bunkovej lýzy významne ovplyvňuje stabilitu proteínu-vysokotlaková a vysokoteplotná metóda vedie k ireverzibilnej agregácii CLK1, čo zdôrazňuje dôležitosť miernej liečby pre prípravu kinázy.

 

 

 

12. Vytvorte galektín -1 so stabilnou schopnosťou viazania ligand

Na prípravu funkčného galektínu -1 Pre štúdie väzby ligandu sa porovnávali stratégie expresie a čistenia štyroch konštruktov (neznačené a jeho značené mutantné galektín {6}}}}}). Kľúčové nálezy naznačujú, že čistenie afinitnej chromatografie laktózy môže účinne preveriť správne zložené proteíny, ale je potrebné ich kombinovať s dôkladnou dialýzou (pufer HEPES), aby sa úplne odstránila laktóza z väzbového miesta a obnovila aktivitu CRD. Galektín divokého typu -1 je náchylný na oxidáciu a inaktiváciu a jeho stabilita zostáva obmedzená aj v prítomnosti redukčných činidiel (obrázok 6). Mutant bez cysteínu však významne zvyšuje dlhodobú stabilitu pri zachovaní porovnateľnej aktivity aglutinácie a tepelnej stability (overenej Nanodsf, ITC atď.) Tým, že eliminuje závislosť disulfidových väzieb.

Obrázok 6. Hydrodynamická charakterizácia rekombinantného galektínu -1 odhaľuje jej nestabilitu

 

13. Odstránenie endotoxínu

Metóda odstraňovania endotoxínu je založená na afinitnej chromatografii vrátane pozitívne nabitých chromatografie (aniónová výmena), použitia polykacionálnych ligandov (ako je poly-L-lyzín (PLL), imobilizovaný polyamín (polymyxín B)) a pridanie surfaktantového tritonu x {}}. Počas procesu čistenia venujte pozornosť príprave roztoku vyrovnávacej pamäte vodou bez LPS a použite nové stĺpce alebo stĺpce, ktoré sa použili iba v iných čisteniach bez LPS. Pre kontamináciu endotoxínu je možné chromatografický systém pumpy/tekutiny inkubovať cez noc v 0. 5M NaOH alebo 4 hodiny v 1. 0 m NaOH. Konečné množstvo LPS vo vzorke sa vyhodnotilo pomocou Limulus amebocytového lyzátu (LAL) a bolo overené, či bola pod hranicou požadovanou pre konkrétnu aplikáciu.

 

14. Proteínový komplex

Expresia a čistenie proteínových komplexov je potrebné optimalizovať podľa špecifických podmienok. Výzvy zahŕňajú nestabilitu alebo nesprávne zloženie podjednotiek. Každá podjednotka môže byť exprimovaná nezávisle a zostavená in vitro alebo koexprimovaná na vytvorenie funkčných proteínových komplexov. Dizajn stavebníctva by sa mal starostlivo zaviesť s vyčistením alebo detekčnými štítkami, aby sa zabránilo zasahovaniu so montážou, najmä ak sú obmedzené zložité informácie a vyžaduje sa viac optimalizácií. Počas procesu čistenia je potrebné vyhodnotiť integritu a stabilitu komplexu. Metódy zahŕňajú SDS-PAGE (detekcia podjednotiek), SEC (homogenita), SEC-MAL (analýza molárnej hmotnosti), hmotnostná fotometria alebo prírodná hmotnostná spektrometria (overovanie hmotnosti). Je potrebné poznamenať, že komplex sa môže disociovať pri nízkych koncentráciách. V tejto dobe je potrebné optimalizovať chromatografickú metódu alebo pufer (napríklad prostredníctvom tepelného driftu alebo skríningových podmienok DSF). Okrem toho môže zníženie krokov čistenia zabrániť strate slabých interakčných podjednotiek a vyvážiť účinnosť čistenia a integritu komplexu.

 

 

 

15. Čistenie komplexov antigénov-protilátky

Komplexy protilátok-antigén sú typické príklady proteínových komplexov. Ich spoločná kokryštalizácia môže odhaliť väzbové vzorce a viesť optimalizáciu inžinierstva protilátok. Tradičné metódy vyžadujú samostatné čistenie antigénov a protilátok a potom ich miešajú. Nedávne štúdie však ukázali, že stratégie koexpresie a ko-puifikácie sú efektívnejšie. Na získanie komplexu je potrebný iba jedno čistenie a súčasne sa môžu stabilizovať nestabilné antigény prostredníctvom protilátok a je možné dosiahnuť dokonca aj expresiu bez značky. V tejto špecifickej situácii sú SDS-PAGE a gélová filtrácia (SEC) zvyčajne dostatočné na vyhodnotenie čistoty a kvality komplexu.

 

Zhrnutie

Čistenie proteínov je základnou technológiou vo vedeckom výskume. Produkcia proteínov akademického rozsahu zvyčajne sleduje štandardné stratégie a môže produkovať vysokokvalitné rozpustné proteíny na úrovni miligramu, ktoré sa široko používajú v štrukturálnej biológii, biochémii a funkčnom výskume. Osobitné požiadavky na následné aplikácie (ako napríklad potreba no endotoxín v experimentoch na zvieratách a kontaminácia nukleázy vo výskume nukleových kyselín) alebo vlastné charakteristiky proteínov (ako je ľahká agregácia, obsahujúca disulfidové väzby alebo vysokú afinitu nukleových kyselín) často vyžadujú prispôsobené roztoky. Tento prehľad v reakcii na tieto osobitné okolnosti navrhuje rafinované stratégie od výberu expresných systémov, návrh konštruktov (optimalizácia štítkov a hraníc domény) na proces čistenia a zavádza kontrolu kvality (napríklad SEC, SDS-PAGE, detekcia aktivity atď.) V kľúčových krokoch. Niektoré aplikácie si tiež vyžadujú ďalšiu analýzu (ako je detekcia endotoxínu a stanovenie zvyškov nukleových kyselín), podobná koncepcii „zabezpečenia kvality“ (QA) v biofarmaceutickom priemysle, tj na zabránenie defektov prostredníctvom systematických procesov. Cieľom formulácie pokynov na kontrolu kvality a objasňovaním špecifických štandardov pre proteínové činidlá používané vo vedeckom výskume je cieľom stanoviť prísnejšie normy čistenia proteínov pre akademické laboratóriá, zvýšiť spoľahlivosť a opakovateľnosť experimentálnych údajov a preklenúť priepasť medzi základnými výskumnými a priemyselnými normami.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5