Membránová technológia a čírenie vakcíny (Ⅱ)

V predchádzajúcom článku sme mali nejaký predbežný úvod do vakcín a stratégií objasňovania vakcín a v ich skúmaní budeme pokračovať vo zvyšku tohto článku. V nadväznosti na vyššie uvedené budeme pokračovať v zdieľaní objasnení vakcín a súvisiacich aplikácií membránového tkaniva.

 

2.2.2 Vplyv fyzikálnych a chemických vlastností vírusu

Po zvážení výrobného systému a metód na odstránenie príslušných kontaminantov v kroku čírenia je dôležité vziať do úvahy charakteristiky vírusu a zamerať sa na maximalizáciu výťažku vírusu.

 

2.2.2.1 Jednoduchá adsorpcia vírusov
Kladne nabité materiály a filtračné pomôcky (ako je kremelina) boli vyvinuté na zlepšenie hĺbkových filtračných účinkov. Hoci kladný náboj zvyšuje zachytávanie nukleových kyselín a HCP, je známe, že diatomit viaže zvyšky buniek a koloidy. Tieto materiály však môžu tiež zadržať vírus prostredníctvom adsorpčného mechanizmu. Keďže vírus je v roztoku zvyčajne záporne nabitý, môže dochádzať k elektrostatickým interakciám s kladne nabitým filtrom.
Vírusy sa tiež môžu viazať svojimi hydrofóbnymi alebo nešpecifickými interakciami s určitými filtračnými materiálmi (ako je kremelina alebo sklenené vlákna). Obalené vírusy sú vďaka svojmu lipidovému obalu náchylnejšie na túto adsorpciu. Ak je vírus adsorbovaný na filter prostredníctvom elektrostatických interakcií a vírusové častice sú oddelené v dôsledku konkurencie soli, opláchnutie filtra vysoko vodivým pufrom môže čiastočne obnoviť vírus. To však môže tiež eluovať kontaminanty, ako sú HCP alebo nukleové kyseliny. Preto je výhodné použitie alternatívneho filtračného materiálu, ako je inertnejší polypropylén.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
Je dobre známe, že vírusy chrípky sú náchylné na stratu adsorpcie počas čírenia. Preto je na prečistenie zberu chrípky vhodné použitie bezdoplatkového filtra, filtra na báze polypropylénu. Thompson a kol. uviedli použitie nominálneho nominálneho 1,2 μm polypropylénového filtra nasledovaného 0 ,45 μm PVDF membránou na objasnenie bunkového vírusu chrípky produkovaného bunkami MDCK. Celkovo sa uskutočnilo deväť čistiacich testov na 20l mierke, naplnením 111 l/m2 pre 1,2 μm polypropylénový filter a 105 l/m2 pre 0,45 μm PVDF filter. Výsledky ukázali, že väčšina spustených vírusov sa zotavila dobre (78-154%). Uviedli tiež až 58% odstránenie hcDNA, ale žiadne významné odstránenie HCP.

 

2.2.2.2 Orezávanie citlivých vírusov

Niektoré vírusy (zapuzdrené alebo nezapuzdrené) vykazujú nízku mechanickú odolnosť a môžu byť zničené šmykovou expozíciou počas krokov odstreďovania a membránovej filtrácie. Strihové sily generované počas purifikačných krokov zahŕňajúcich filtráciu alebo chromatografiu môžu spôsobiť odpadnutie vírusového obalu, a tým ovplyvniť infekčnosť. V závislosti od veľkosti, hrúbky a geometrie kapsidy môže byť vírusová kapsida krehká alebo naopak odolná voči vysokým tlakom. Niektoré obalené vírusy, ako napríklad vírusy chrípky, sú elastické voči mechanickému namáhaniu a vydržia veľkú deformáciu. Na druhej strane šmyková sila môže spôsobiť, že obal menej odolných vírusov, ako sú retrovírusy, odpadne, čím sa ovplyvní infekčnosť vírusu.

Extracelulárne generované obalové VLP sú tiež veľmi zraniteľné. Vysoké šmykové rýchlosti vznikajú v odstredivom procese, hlavne na vstupnej a výstupnej časti (vysoké šmykové rýchlosti vznikajú na rozhraní plyn-kvapalina). Keď bol vírus purifikovaný gradientovou centrifugáciou, transdukčná schopnosť niektorých retrovírusov bola výrazne oslabená. Pri navrhovaní odstredivej separácie je potrebné zvážiť relatívnu nestabilitu vírusových častíc voči šmykovým silám. Odstredivá sila nie je jediným zdrojom šmykového rázu, dôležitejšia je konštrukcia zariadenia, najmä pri dovoze a vývoze má tiež výrazný šmykový ráz. Rozdiely v dizajne rôznych mierok môžu viesť k rozdielom vo výťažku a výťažnosti vírusov citlivých na strih v rôznych mierkach.

Vírusy citlivé na strih by mali byť starostlivo navrhnuté, pretože veľkosť šmykového napätia a čas vystavenia stresu (v dôsledku recirkulácie) môžu byť vysoké. Pre vírusy citlivé na strih sa uprednostňujú zariadenia s otvoreným okruhom (zariadenia s dutým vláknom alebo s otvorenou doskou), aby sa znížili turbulencie a šmykové sily v prívodnom kanáli.

Výber prevádzkových parametrov by mal tiež minimalizovať poškodenie vírusových častíc: nízky priečny tok, stredný transmembránový tlak (TMP) a krátky čas spracovania.

Kontaminácia membrány pod vysokým tlakom vedie k strate vírusovej infekčnosti, pravdepodobne v dôsledku síl, ktoré strihové pôsobenie môže pôsobiť na vírusový obal. Separácia založená na membráne je založená na veľkosti a akumulácia vírusových inhibítorov s veľkou molekulovou hmotnosťou a vírusových častíc môže znížiť infekčnosť vírusových vektorov.

Degradácia vírusov citlivých na strih počas hĺbkovej filtrácie nie je široko zdokumentovaná. Strata vírusov pri hĺbkovej filtrácii sa najčastejšie pripisuje zachyteniu, adsorpcii alebo časovo a teplotne závislej vírusovej degradácii produktu. V skutočnosti, aj keď v systémoch NFF môže dôjsť k mechanickému namáhaniu, expozičný čas produktov NFF na strihanie je v porovnaní s inými technológiami veľmi krátky z dôvodu rýchleho jediného prechodu, ktorý sa vyskytuje u produktov NFF.

 

2.2.2.3 Priesečník podľa veľkosti otvoru

Vírusy nad 100 nm možno zachovať odstránením mykoplazmy alebo membrán sterilného stupňa (0,22 μm a menej). V tomto prípade by sa mala venovať osobitná pozornosť výberu filtrov. Pre mikrofiltračné kroky TFF sú pre dobré kanáliky produktu preferované 0.45μm alebo 0,65μm membrány. Pri viacstupňovej filtrácii NFF je najhustejšia vrstva väčšia alebo rovná 0,45 μm. Pri výbere hlbokého filtra by ste mali byť opatrní, pretože niektoré zariadenia s hlbokým filtrom môžu obsahovať vrstvu filmu, čo môže viesť k strate produktu pri zadržiavaní. Agregácia vírusu negatívne ovplyvňuje produkciu vírusu a zvyšuje retenciu vírusu v dôsledku veľkosti vírusu.

Podľa patentu Andreho a Champluviera môže homogenizácia zabrániť alebo obmedziť upchávanie filtra zmenšením veľkosti kameniva, čím sa dosiahne vyšší výťažok. Homogenizácia tiež zlepšila filtračnú kapacitu zberu, ktorá sa zvýšila 2.4-3-krát.

Príliš veľa nečistôt môže brániť obnoveniu vírusu. Nečistoty majú tendenciu upchávať filter a upchaté póry membrány môžu viesť k zníženiu rýchlosti prechodu vírusu. V patente de Vochta a Veenstra sa uvádza, že priame objasnenie vysokej bunkovej hustoty Per. Odber pomocou TFF ({{0}}.65 alebo 0.2 μm membrána) viedol k obnove vírusu bez adenovírusov. Zotavenie možno dosiahnuť selektívnym precipitačným odstránením DNA hostiteľskej bunky pred krokom 0,65 μm TFF. 70 % adenovírusov.

 

 

2.3 Prípadová štúdia: Optimalizácia objasnenia vírusovej vakcíny

Na medzinárodnej konferencii o biologických procesoch v roku 2011 predstavila spoločnosť Sanofi Pasteur racionálny prístup k skríningu filtrov na vývoj nových objasnených sekvencií pre kandidátske vírusové vakcíny. Cieľom výskumu je prekonať problémy, ktorým čelíme pri optimalizácii procesov bunkovej a vírusovej kultúry. Modifikácie protiprúdového procesu mali za následok 20 % stratu výťažku a predčasnú kontamináciu filtra počas kroku čistenia, čo neviedlo k žiadnemu zväčšeniu. Aby sa vytvoril robustný a škálovateľný krok čírenia, bol potrebný úplný opätovný vývoj filtračnej sekvencie s mierou obnovy vírusu vyššou ako 85 %.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80 %. Výťažnosť filtrov na báze esteru celulózy a sklenených vlákien závisí od hodnotenia filtra (20 % alebo 90 %).

V druhom kroku spoločnosť Sanofi Pasteur vyhodnotila niekoľko kombinácií (sekvencie fázy 2 alebo fázy 3) siedmich filtrov vopred vybraných v skríningovej štúdii. Test klasifikácie konštantného prietoku sa uskutočnil s malým filtrom. Okrem toho tento experiment použil vyšší výťažok ako skríningová štúdia. Na základe výsledkov vírusovej obnovy a filtračnej kapacity tím vybral dve najlepšie kombinácie na ďalšie štúdium.

- Sekvencia 1 (2. fáza): 30 μm nominálny menovitý skladaný polypropylénový predfilter, po ktorom nasleduje kompozitný ester celulózy a viacvrstvový filter zo sklenených vlákien (1/0,5 μm pórovitosť)

- Sekvencia 2 (stupeň 3): rovnaký predfilter (30 μm nominálny nominálny polypropylénový filter), po ktorom nasleduje medziľahlý viacvrstvový polypropylénový filter a nakoniec asymetrický polyétersulfónový film.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85 %), ako je znázornené na obrázku 1.

Obrázok 1 Priemerná obnova vírusu v každom kroku filtrovania. Štúdie stability boli hodnotené pre tri filtračné sekvencie, z ktorých iba sekvencia 1 s použitím 30 μm nominálneho nominálneho skladaného polypropylénu a 1.0/0,5 μm ester celulózy a filter zo sklenených vlákien splnili globálny cieľ obnovy .

Centrifugácia bola tiež hodnotená ako primárny krok čírenia, po ktorom nasledovala konečná filtrácia {{0}},45 μm. Testovalo sa niekoľko párov rýchlosť/trvanie. Hoci sa rýchlosť filtrácie 0,45 μm zvýšila dvakrát, konečný výťažok bol nižší ako cieľových 85 %. V dôsledku toho sa odstreďovanie ďalej neskúmalo.

Nakoniec sa vo väčšom meradle (veľkosť bioreaktora 160 1) vyhodnotila výkonnosť filtračných sekvencií z polypropylénu a sklenených vlákien. Postupnosť filtrovania je znázornená na obrázku 2.

Obrázok 2 Objasňuje kombináciu filtrov a grafické znázornenie krokového výťažku reťazca. Vlak A je tradičný proces a vlak B je optimalizovaný proces. Optimalizovaná sekvencia B môže zmenšiť predfiltračnú oblasť 3-krát, zrušiť medzistupeň filtrácie a zmenšiť konečnú filtračnú oblasť 10-krát, čím sa zvýši globálna obnova vírusu o 3 %.

Niekoľko šarží bolo úspešne vyčistených bez známok zablokovania filtra, procesný čas bol v súlade s výrobnými limitmi a výťažok vírusu bol > 85 percent. Optimalizácia kroku objasnenia nemala žiadny vplyv na následné kroky a kľúčové atribúty kvality vakcíny. Preto bola zvolená sekvencia čírenia použitá v procese výroby vakcíny (bioreaktor s veľkosťou 1000 1) a výkonnosť bola úspešne potvrdená.

 

03 Objasnenie bakteriálnych vakcín

3.1 Úvahy o objasnení bakteriálnych vakcín

Podľa lekárskeho tezauru (2015) je bakteriálna vakcína definovaná ako suspenzia zriedených alebo usmrtených baktérií alebo ich antigénnych derivátov, ktorá sa používa na vyvolanie imunitnej odpovede na prevenciu alebo liečbu bakteriálnych ochorení. Vo všeobecnosti možno bakteriálne vakcíny rozdeliť do štyroch podkategórií na základe typu aktívneho antigénu. Tento agent môže byť:

- Zabíja alebo oslabuje celé živé baktérie. Tiež známa ako BCG vakcína.

- Purifikácia antigénnych determinantov (podjednotkové vakcíny). Vakcína proti antraxu alebo acelulárna vakcína proti čiernemu kašľu.

- Bakteriálne toxíny (toxoidy). Toxoidy záškrtu a tetanu.

- Plazmid (pDNA).

Vzhľadom na veľkú heterogenitu produktov tejto rodiny, výzvy v procese upstream a downstream do značnej miery závisia od typu vyrábanej vakcíny. Preto môže byť po počiatočnom fermentačnom kroku purifikovaný alebo nečistený, takže sa môže uskutočniť krok čírenia.

 

3.2 Stratégia objasnenia bakteriálnej vakcíny

3.2.1 Toxoid

Dva najbežnejšie toxoidy produkované na použitie vo vakcíne sú diftéria a tetanus, ktoré sú produkované Corynebacterium diphtheriae a Clostridium tetani, v tomto poradí. Výroba oboch vakcín podlieha prísnym regulačným požiadavkám. Technická správa WHO a jej prílohy obsahujú jasné odporúčania na zabezpečenie kvality, bezpečnosti a účinnosti vakcín proti tetanu a záškrtu. Na výrobu oboch vakcín sa vzťahujú všeobecné správne výrobné postupy a zamestnanci musia byť riadne vyškolení a musia dostať posilňovaciu imunizáciu proti obom chorobám.

GMP striktne vyžaduje, aby bola preukázaná čistota a kvalita konečného produktu. Podľa WHO a EP musí byť účinnosť finálnej vakcíny proti tetanu stanovená porovnaním in vivo alebo akoukoľvek inou overenou metódou s vhodnou referenčnou látkou kalibrovanou v medzinárodných jednotkách podľa Medzinárodného štandardu pre tetanový toxoid. Aktualizované požiadavky na účinnosť boli zverejnené v roku 2011 a môžu sa líšiť v závislosti od spôsobu hodnotenia. Musí sa preukázať aj bezpečnosť (beztoxínová a regeneračná toxicita) každej šarže vakcíny. Napokon treba riešiť stabilitu vakcín, najmä v reálnom čase.

 

3.2.2 Vakcína proti plazmidovej DNA

Vakcíny plazmidovej DNA sa používajú na účely zdravia zvierat a niekoľko vakcín plazmidovej DNA na použitie u ľudí je v rôznych štádiách vývoja a klinického hodnotenia. Po fermentácii E. coli sa baktérie zbierajú a štiepia, aby sa uvoľnila plazmidová DNA.

Odstránenie bunkového odpadu sa zvyčajne uskutočňuje centrifugáciou alebo filtráciou. Tejto téme sa v nedávnych publikáciách veľmi venovali. V tejto publikácii sú súčasné upstream, downstream a formulačné procesy a výzvy pDNA.

Autori tiež poskytujú pohľad na medzery v každom kroku typického výrobného procesu pDNA a potenciálne budúce inovácie a / alebo súčasné technologické medzery, ktoré by mohli viesť k ďalšej optimalizácii procesu.

Plazmidové DNA vakcíny sa pripravujú v dvoch krokoch. Najprv sa z kultivačného média odstránia bakteriálne bunky a po druhé sa odstránia zvyšky buniek po lýze buniek. V závislosti od rozsahu sa bunky zbierajú pomocou centrifugácie alebo TFF mikrofiltrácie. Disková centrifúga sa prerušovane vysúva pri vysokej rýchlosti a výťažok superzvinutých plazmidov je slabý v dôsledku poškodenia šmykom počas vybíjania. Ak sa musí použiť odstreďovanie, najlepšie je odstredivka s pevnou misou. Ploché zariadenia TFF s otvoreným kanálom s mikrofiltračnými membránami 0 0,1 alebo 0 ,2 μm alebo zariadeniami s dutým vláknom môžu dobre fungovať.

Pretože zariadenia z dutých vlákien majú vysokú pevnú nosnosť, niekedy sa im dáva prednosť. Tieto procesy zvyčajne fungujú pri 3-5-násobku koncentrácie, po ktorej nasledujú 3-5 objemy transfiltrácie. Aby sa znížil strih a lepšie sa kontrolovala polarizácia membrány, dôrazne sa odporúčajú operácie kontroly penetrácie. Hoci sú odstredivky nákladovo efektívnejšie vo veľkých komerčných prevádzkach, procesy v menšom meradle majú tendenciu používať filtráciu kvôli prenosnosti a jednoduchosti prevádzky.

Na uľahčenie spracovania sa použili flokulanty, ktoré však môžu viesť k strate produktu. Niektorí odporúčajú použiť aj inertné častice kremeliny, po ktorej nasleduje vrecová filtrácia.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0.45 m) membránové filtre sú dobré pri odstraňovaní bunkového odpadu. Kvôli silnému upchávaniu bunkových zvyškov sa uprednostňuje nízky prietok alebo nízkotlaková filtrácia. Na tento krok sa použili mikrofiltre na báze Tff a vreckové filtre v priemyselnom meradle. Statické (v miešacej nádobe) a kontinuálne (pomocou in-line statického mixéra) praskanie vyžaduje rôzne filtre.

 

3.3 Prípadová štúdia: Porovnanie účinnosti centrifugácie, metód NFF a TFF na objasnenie tetanových toxínov

Muniandi a kol. porovnávali tri rôzne metódy na čistenie tetanových toxínov a toxoidov z fermentačných tekutín, konkrétne centrifugáciu, hĺbkovú filtráciu (NFF) a TFF. Testovaný materiál bol vyrobený v 400l fermentore s použitím modifikovaného Millerovho (MMM) média. V centrifugačnej štúdii boli bunky oddelené od srdca pri 4000 ot./min. v nádobe s objemom 6 x 1 l počas 60 minút. Boli odobraté vzorky supernatantu na detekciu regenerácie toxoidu. Hĺbková filtrácia využíva 0,45 μm a 0,22 μm hlboké filtre s obsahom kremeliny a celulózy na vyčírenie fermentačného bujónu. Proces sa uskutočňuje pri teplote 35 stupňov a 12 psi.

Otvorený plochý panel TFF modul je tepelne spojený s 0.22μm PVDF membránou metódou TFF. Proces čírenia na báze TFF sa uskutočňoval pri rýchlosti krížového toku 2000 l/h pri 23 stupňoch a vyčírený filtrát sa koncentroval pri rýchlosti krížového toku 1000 l/h pri 25 stupňoch s použitím bežnej TFF sendvičovej 30 kD PES membrány. Vyčírená mäsová tekutina (asi 6 l) sa v tomto procese ultrafiltrácie 10-krát skoncentruje. Testy tetanového toxoidu sa uskutočňovali na koncentrovaných vzorkách zachytávača, aby sa vyhodnotila regenerácia produktu.

Hlboká filtrácia viedla k výťažnosti produktu približne 89 %, pričom jednotky TFF viedli k výťažnosti produktu nad 97 %. Procesy mikrofiltrácie a ultrafiltrácie konzistentne poskytujú vyššie výťažky produktu ako proces NFF. Tieto výsledky sú založené na flokulačných testoch (Lf).

 

04Objasnenie polysacharidových vakcín

4.1 Zváženie objasnenia polysacharidovej vakcíny

Proces výroby tak neviazaných/voľných polysacharidových vakcín, ako aj spojených polysacharidových vakcín začína kultiváciou hostiteľských baktérií vo fermentore. Na konci fermentácie môžu byť baktérie ošetrené čistiacimi prostriedkami, ako je DOC (deoxycholát sodný), Triton®X{0}} alebo inými vhodnými činidlami, aby sa baktérie zničili a podporili sa uvoľňovanie polysacharidov. Kvôli veľkej kapacite batérie nie je zber priamo cez NFF ekonomicky realizovateľný, pretože priepustnosť môže byť veľmi nízka. Ideálnou voľbou je preto použiť odstredivku na oddelenie bunkových zhlukov. Je možné použiť aj mikrofiltračný rozsah TFF. Bezbunkové centrum/penetrant obsahujúci požadovaný polysacharid sa ďalej vyčistí pomocou systému hĺbkovej filtrácie NFF, po čom nasleduje filtrácia s biologickým šľahaním a potom sa pokračuje v ďalšom čistení na ďalšie čistenie.

 

4.2 Stratégia objasnenia polysacharidovej vakcíny

4.2.1 Postup prvého objasnenia

Centrifugácia je jednou z najbežnejších techník na separáciu buniek z fermentačných tekutín. V závislosti od rozsahu je možné zvoliť kontinuálne odstreďovanie alebo dávkové odstreďovanie. Je dôležité poznamenať, že správna optimalizácia podmienok centrifugácie a ich prevádzky je nevyhnutná pre úspešné následné čistenie. Pri výbere špecifickej TFF membrány a veľkosti pórov je dôležité mať na pamäti molekulovú hmotnosť polysacharidov, ktoré sú často veľké a štrukturálne zložité, s molekulovými hmotnosťami v rozsahu približne 500kDa na viac ako 1000 kDa. Vďaka veľkej veľkosti otvorených pórov môže použitie 0,22 μm, 0,45 μm, 0,65 μm MF membrán zabezpečiť úspešnú obnovu molekúl PS v osmotickom roztoku.

 

4.2.2 Postup sekundárneho objasňovania

Čistota/zákal bezbunkového fermentačného roztoku, ktorý dosiahne krok sekundárneho čírenia, závisí od špecifických baktérií, typu štiepenia, individuálneho typu séra a techniky použitej pre krok primárneho čírenia. Zákal v centre sa môže pohybovať od približne 50 do 150 NTU. Kladne nabitý hĺbkový filter s frakčnou hustotou vyrobený z impregnovanej kremeliny s naplnenými celulózovými vláknami možno použiť na prečistenie a zníženie jeho zákalu na < 5 NTU.

Objemová priepustnosť tohto hlbokého filtra sa môže pohybovať od približne 150 l/m3 do 250 l/m3. Typicky sa vyčírený roztok produktu prefiltruje cez následnú 0,45 μm biologicky podporovanú redukčnú membránu alebo 0,22 μm sterilizovanú membránu, aby sa odstránili všetky zostávajúce bunkové častice, koloidy a potenciálne mikroorganizmy.

 

4.3 Prípadová štúdia: Objasnenie centra fermentačného bujónu Streptococcus pneumoniae po centrifugácii

Bunky sa oddelili pridaním {{0}}.1 % (v/v) fermentačného bujónu typu 8 Streptococcus pneumoniae (20 1) kontinuálnou centrifugáciou. Stred kolekcie sa filtruje cez dva oddelené kladne nabité hlboké filtre z kremeliny obsahujúce celulózové vlákna. Individuálny filtrát hlbokého filtra sa potom prefiltroval cez membránu PVDF 0, 45 μm s biologicky plnenou redukciou. Všetky filtračné testy boli vykonané v režime konštantného prietoku s peristaltickými čerpadlami. Filtračné testy s použitím nabitého hlbokého filtra a fermentačného bujónu Streptococcus pneumoniae sérotypu 8 viedli k poklesu zákalu z približne 120 NTU na 3 NTU. Testy sa uskutočnili pri prietoku 140 150 l/m2/h a koncovom tlakovom rozdiele 20-25 psi, s objemovým prietokom približne 180-200 l/m2.

Podobné filtračné testy sa uskutočnili na fermentačnom bujóne Streptococcus pneumoniae sérotypu 19A. Odstredená kvapalina 19A sa vyčíri cez naplnený hlboký filter, ktorý zníži zákal z približne 40 NTU na 3 NTU. Testy sa uskutočňovali pri konštantnom prietoku približne 140-160 l/m2/h a objemový prietok 200-230 l/m2 sa dosiahol pri koncovom tlaku približne 15 psid. HLPC analýza vzoriek produktu odobratých počas testov hodnotenia filtrácie nepreukázala žiadnu významnú stratu výťažku pre hĺbkovú filtráciu alebo membrány 0 0,45 μm (alebo 0,22 μm).

 

05 Záver

Vývoj procesov čírenia vyžaduje integráciu niekoľkých jednotkových procesov, ako je centrifugácia, TFF-MF, hĺbková filtrácia a aseptická filtrácia. Optimalizácia procesu objasnenia si vyžaduje pochopenie toho, ako sa rôzne jednotkové operácie navzájom ovplyvňujú. Výzvou je vybrať technológie a nástroje (zariadenia a prípravky), aby vyhovovali čoraz zložitejším požiadavkám procesných kvapalín vyrábaných dnešnými efektívnejšími bioreaktormi. Zvýšenie upstream produktivity (vírusový titer, hustota buniek atď.), zvyšky buniek a produkty lýzy buniek zvyšujú náročnosť procesu čírenia a mätú výber separačného a filtračného zariadenia.

Pri výbere procesnej stupnice je potrebné zvážiť dizajn zariadenia, jednoduchosť použitia a čistotu. Tým sa zabezpečí efektívna konverzia a bezpečnosť obsluhy pri manipulácii s vyradenými filtrami. Aby sa rozvinul proces objasňovania, je dôležitá silná integrácia krokov objasňovania, aby sa zabezpečilo, že spracovanie úrody je nákladovo efektívne. Na uľahčenie laboratórneho testovania, pilotnej výroby a spracovania v plnej veľkosti je k dispozícii celý rad filtračných jednotiek. Implementáciou dobre navrhnutého pracovného plánu zväčšenia, ktorý vyhodnocuje viaceré možnosti objasňovania, je možné s istotou vyberať a dimenzovať filtre na čírenie na ochranu následných operácií jednotky a zároveň znižovať prevádzkové náklady.

Objasnenie vakcín predstavuje niekoľko výziev. Typicky musí byť filtračný proces prispôsobený produkčnému systému, inaktivačnému alebo lyzačnému činidlu a prezentácii antigénu, nie nevyhnutne vakcínam. Tradičné očkovacie procesy zvyčajne používajú centrifugáciu na počiatočné vyčírenie vakcíny. Vďaka moderným vakcínam s viacerými technologickými platformami a menšími objemami spracovania sú vakcíny vhodnejšie na čírenie pomocou membránových technológií. Novo vyvinuté vakcíny využívajúce moderné bunkové línie a expresné systémy a využívajúce lepšie definované podmienky bunkovej kultúry spôsobujú, že mnohé očkovacie procesy sú vhodnejšie pre filtráciu.

 

Heterogenita antigénnej zložky alebo „cieľového antigénu“ vakcínových produktov však zvyšuje zložitosť filtračného objasňovania. Antigény sa líšia veľkosťou, povrchovou chémiou a nábojom. Tieto charakteristiky ovplyvňujú výťažok a výťažnosť antigénov. Vakcíny predstavujú jedinečné výzvy na objasnenie, najmä kvôli veľkosti ich makromolekúl. To v kombinácii s problémami týkajúcimi sa objasňovania zvyšuje potrebu usmernení o stratégiách rozvoja procesov.

Veľkosť a rozsah prevádzky na výrobu vakcín v komerčnom meradle má významný vplyv na výber technológie čírenia. Keďže sa nachádza pred procesom, správna optimalizácia čírenia je rozhodujúca pre úspech následných jednotkových operácií, maximalizuje výťažok, regeneráciu a robustnosť procesu. Zatiaľ čo centrifugácia zostáva životaschopnou technickou možnosťou na primárne čírenie, mikrofiltračné jednotky s otvoreným kanálom (TFF) na primárne čírenie a jemné hĺbkové filtre alebo membránové filtre na sekundárne čírenie získavajú vo vakcínovom priemysle uznanie. Táto zmena je poháňaná potrebou rýchlejšieho spracovania, rýchleho vývoja procesov, prenosných procesov a jednorazových implementácií. NFF ponúka ekonomický proces vhodný pre malé až veľké možnosti na jedno použitie. Vzhľadom na meniace sa regulačné potreby dostupnosť predaseptických zariadení alebo modulov na gama ožarovanie navrhnutých na autoklávovanie podporuje rýchlejšie prispôsobenie technológií založených na NFF alebo TFF.

Mnohé klasické očkovacie procesy zahŕňajú evolúciu operácií objasňovacej jednotky, do značnej miery kvôli regulačným obmedzeniam a súvisiacim vysokým nákladom na revalidáciu a opätovné predloženie alebo klinické skúšky. Platformový proces využívajúci číriacu schému založenú na filtrácii bol široko používaný v niekoľkých biologických látkach s vysokým stupňom úspechu. Príklady a prípady načrtnuté v tomto dokumente ukazujú, že výrobcovia vakcín majú potenciál dosiahnuť túto úroveň stability, ekonomickej životaschopnosti a použiteľnosti na jedno použitie podľa vzorového prístupu.

Ďalšími výhodami filtrácie oproti centrifugácii sú vírusy citlivé na strih alebo vírusy, ktoré majú tendenciu sa hromadiť na rozhraní vzduchu. Keďže výrobcovia zariadení prinášajú na trh nové produkty, výrobcovia vakcín budú aj naďalej lepšie vybavení na proces objasňovania.

 

Guidling Technology ako prvá spoločnosť v lokalizačnom okruhu nazbierala dostatočné relevantné skúsenosti s objasňovaním vakcín. Guidling Technology je vývojová a produkčná spoločnosť so zameraním na biofarmaceutické a bunkové kultúry, purifikáciu a separáciu. Produkty sú široko používané v biomedicíne, diagnostike, priemyselnej filtrácii tekutín, detekcii, čírení, čistení a koncentrácii; Guidling úspešne vyvinul ultrafiltračnú odstredivkovú skúmavku, ultrafiltračnú/mikrofiltračnú membránovú kazetu, filter na odstraňovanie vírusov, filtračné zariadenie s tangenciálnym prietokom, hlboký membránový zásobník atď., Ktoré plne spĺňajú aplikačné scenáre biofarmaceutických a bunkových kultúr.

Naše membrány a membránové filtre sú široko používané pri koncentrácii, extrakcii a separácii predfiltrácie, mikrofiltrácie, ultrafiltrácie a nanofiltrácie. Naša široká škála produktových radov, od malých jednorazových laboratórnych filtrácií až po produkčné filtračné systémy, testovanie sterility, fermentáciu, bunkové kultúry a ďalšie, dokáže uspokojiť potreby testovania a výroby.