Technológia inaktivácie a odstraňovania vírusov z krvných produktov

Krvné produkty sú „bielkovinové zložky plazmy alebo zložky krvných buniek, ako je ľudský krvný albumín, ľudský imunoglobulín, koncentrát červených krviniek s ľudským koagulačným faktorom (prírodným alebo rekombinantným) atď., oddelené od zdravej ľudskej plazmy alebo špecificky imunitnej ľudskej plazmy, purifikované alebo vyrobené technológiou rekombinantnej DNA na diagnostiku, terapiu alebo pasívnu imunoprofylaxiu“. Krvné produkty zohrávajú dôležitú úlohu v lekárskej pohotovosti, pri záchrane vojnových zranení a pri prevencii a liečbe niektorých špecifických chorôb.

 

Regulačné pozadie

Postupy na zaistenie bezpečnosti musia zabezpečiť, aby konečný liek bol bezpečný pre regulačné orgány a v konečnom dôsledku aj pre pacientov a verejnosť. V 90. rokoch vydala Medzinárodná koordinačná konferencia (ICH 1998) „Q5A: Hodnotenie vírusovej bezpečnosti biotechnologických produktov bunkových línií ľudského alebo zvieracieho pôvodu“ (Q5A: Hodnotenie vírusovej bezpečnosti), čím sa vytvoril celosvetový štandard pre vírusovú bezpečnosť.

ICH Q5A popisuje viacvrstvovú schému testovania a overovania zúčtovania na dosiahnutie tohto cieľa. Testovací program sa zameriava na bunkovú banku, zber surovín a bioreaktorov, doplnený o analýzu rizika produktu. Okrem testovania ICH Q5A vyžaduje, aby sa následná dekontaminácia vyhodnotila ako opatrenie bezpečné pri poruche, keď sa proti prúdu nezistia žiadne kontaminanty. Overenie klírensu zaisťuje, že ak sa akýkoľvek vírus vyhne testovaciemu režimu, môže byť odstránený a/alebo inaktivovaný skôr, ako skončí v konečnom lieku.

 

Pozadie celkového programu ochrany proti vírusom

V modernej biotechnologickej výrobe (alebo biospracovaní) sú zvyčajne tri alebo štyri jednotkové operácie v celej purifikovanej sekvencii, schopné odstrániť alebo inaktivovať vírus. To zahŕňa určité chromatografické kroky (ako je proteín A alebo výmena aniónov), kultiváciu s nízkym pH alebo detergenty a filtre na zadržiavanie vírusov. Nie všetky tieto kroky účinne odstránia alebo inaktivujú všetky vírusy.

Napríklad kultúra s nízkym pH je zvyčajne neúčinná na inaktiváciu neobaleného vírusu, ale funguje dobre na inaktiváciu obaleného vírusu. Za určitých prevádzkových podmienok aniónová výmenná kolóna nemusí byť schopná viazať a odstraňovať neutrálne izoelektrické vírusy z prúdu produktu, ale je účinná proti kyslým vírusom.

Ide o kombináciu troch až štyroch nezávislých a ortogonálnych jednotkových operácií, ktoré spoločne zaisťujú vírusovú bezpečnosť biotechnologických produktov.

 

Všeobecne sa predpokladá, že robustný, efektívny a spoľahlivý krok spracovania bude schopný odstrániť alebo inaktivovať veľký počet vírusov (typicky definovaných ako 4 log10 alebo viac, kde hodnota logaritmu zníženia alebo LRV sa vypočíta ako log10 z celkového počtu počet vírusov na vstupe vydelený celkovým počtom vírusov na výstupe). LRV však nemožno použiť ako jediné absolútne meradlo účinnosti kroku. Údaje môžu byť predbežné. Dá sa ľahko modelovať, je relatívne necitlivý na zmeny v podmienkach procesu a účinný proti celému radu vírusov (WHO 2004).

Vírusová filtrácia je všeobecne uznávaná ako taký silný a efektívny procesný krok a je kľúčovou zložkou celkovej stratégie na minimalizáciu rizika exogénnych a endogénnych vírusových častíc počas výroby biotechnologických produktov.

Vírusové filtre často fungujú prostredníctvom silných retenčných mechanizmov založených na veľkosti. Na základe tohto silného mechanizmu účinku je pravdepodobnejšie, že vírusové filtre než chromatografické kroky poskytujú predvídateľné zadržiavanie vírusov pre celý rad vírusov. Je to preto, že je menej pravdepodobné, že filter bude ovplyvnený rozdielmi vo fyzikálno-chemických vlastnostiach rôznych vírusov a interakciami vírus-živica regulovanými prevádzkovými podmienkami. Preto sa krok vírusovej filtrácie bežne používa v dobre navrhnutých procesoch purifikácie rekombinantných terapeutických proteínov (EMEA 1996), ktoré sa tiež ukázali ako robustné v priemysle spracovania plazmy.

 

Krvné produkty sú však ako dvojsečná zbraň, ktorá nielenže zachráni tisíce životov, ale má aj možnosť rozširovania chorôb a ohrozuje ľudské zdravie. Podľa štatistík v rokoch 1977 až 1984 najmenej 30000 príjemcov krvi v Spojených štátoch dostalo krv infikovanú vírusom AIDS. V roku 1985 sa 1200 z 3000 hemofilikov vo Francúzsku nakazilo AIDS prostredníctvom krvných transfúzií alebo krvných produktov.

Podľa Svetovej zdravotníckej organizácie je 5 až 10 % infekcií AIDS na celom svete spôsobených transfúziami krvi alebo krvných produktov infikovaných AIDS. Prvý prípad AIDS v Číne bol infikovaný použitím dovezených krvných produktov infikovaných vírusom AIDS. Okrem toho bol hlásený aj prenos ochorení hepatitídy B a C v dôsledku transfúzie krvi a krvných produktov.

 

1. Hlavné vírusy prenášané krvnými produktmi a ich charakteristika

Existuje mnoho typov vírusov, ktoré sa prenášajú krvou a krvnými produktmi, ako ukazuje tabuľka 1. Spomedzi nich sú HIV, HBV a HCV znepokojené domácimi a zahraničnými lekárskymi kruhmi z dôvodu ich vysokej miery infekcie a vážneho poškodenia.

Pretože krv a krvné produkty majú možnosť šírenia vírusov, vážne ovplyvnila jej uplatnenie v prevencii a liečbe chorôb. Preto sa pri výrobe krvných produktov musia pridať procesy inaktivácie a odstraňovania vírusov, aby sa zabezpečila bezpečnosť krvných produktov.

2. Hlavné metódy inaktivácie a odstránenia vírusu

Aby sa zabezpečila bezpečnosť krvných produktov, okrem výberu darcov krvi, imunizácie tam, kde je to možné, a prísneho testovania odobratej krvi a iných opatrení, je dôležitým spojením inaktivácia a odstránenie vírusovej liečby krvných produktov bezpečnosť transfúzie krvi. Nižšie je podrobne popísaných niekoľko bežne používaných a účinných metód na inaktiváciu a odstránenie vírusov.

 

I. Metódy inaktivácie vírusov

1. Pasteurova metóda

Teoretickým základom tejto metódy je, že rýchlosť deštrukcie vírusovej štruktúry je oveľa vyššia ako rýchlosť deštrukcie proteínovej štruktúry prostredníctvom výberu teploty a času pôsobenia. Takmer 50-ročné výsledky klinického používania a nedávne pokusy na zvieratách potvrdili, že albumín v roztoku po 60 stupňoch 10-hodinovej tepelnej úpravy, teda Pasteurovej dezinfekcii, môže nielen inaktivovať HBV, ale aj inaktivovať HCV a HIV, vďaka čomu je albumín najspoľahlivejší. krvný produkt vo vírusovej bezpečnosti.

Nedávno bol Pasteurov proces rozšírený o výrobu IVIG, FVI, FIX, fibrinogénu a ďalších produktov. Bridonnccu a kol. pridali tento proces inaktivácie vírusu k procesu IVIG výroby etanolu pri nízkej teplote, to znamená, že Pasteurova metóda bola implementovaná za podmienok bez stabilizátora, nízkej soli a kyslosti a titer vírusu sa znížil o 5 log. Simmonds a kol. testovali transfúziou prenášaný vírus (TTV) koncentrovaných prípravkov FVⅢ a FIX klinicky používaných v Spojenom kráľovstve a zistili, že miera detekcie TTV produktov bez inaktivácie Pasteurovho vírusu bola 50 % až 75 % a miera pozitívnej detekcie produktov po Pasteurovej inaktivácii bola 0.

Pozitívna miera TTV bola 27 % u 84 pacientov s hemofíliou v Spojenom kráľovstve, ktorí používali produkty s neinaktivovaným faktorom zrážanlivosti, zatiaľ čo iba 1 z 19 pacientov používajúcich produkty s inaktivovaným faktorom zrážanlivosti bol pozitívny, s mierou pozitívnej detekcie 5 %. Preto je proces inaktivácie vírusu veľmi účinný pri zlepšovaní bezpečnosti krvných produktov.

 

2. Organické rozpúšťadlo kombinované s povrchovo aktívnou látkou (metóda S/D)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 %. Veľký počet krvných produktov inaktivovaných metódou S/D sa dlhodobou klinickou aplikáciou preukázal ako bezpečný a spoľahlivý, takže sa široko používajú. Táto metóda však nemá žiadnu inaktivačnú schopnosť proti parvovírusu B19, HEV a iným vírusom nepotiahnutým lipom.

 

3. Metóda inaktivácie suchým teplom

Inaktivácia suchým teplom znamená, že lyofilizovaný prípravok sa spracuje zahrievaním a vírus sa usmrtí suchým teplom. Bežne používané metódy suchého tepla sú 60 stupňov ~ 80 stupňov , 10~72 h metóda ohrevu a 80 stupňov , 72 h metóda úpravy. Už začiatkom 80-tych rokov 20. storočia bolo užitočné zahriať lyofilizovaný koncentrovaný prípravok FVIII a protrombínový komplex na 60 °C ~ 80 °C počas 10-72 hodín. Bolo však dokázané, že táto metóda nemôže úplne inaktivovať HBV, HCV, HIV. Suché tepelné ošetrenie pri 80 stupňoch a 72 hodinách sa ukázalo ako účinné pri inaktivácii HBV, HCV a HIV. Nedávno sa objavili aj správy o lyofilizovaných prípravkoch koagulačných faktorov ošetrených pri 100 stupňoch. Xu Jinbo et al ošetrili IgG pri 100 stupňoch počas 30 minút a inaktivovali vírus vezikulárnej stomatitídy 8,2 Log. Niektorí ľudia vymrazia sušený FVIII pri 68 stupňoch počas 72 hodín, v suchom stave a potom sa zahrievajú na 100 stupňov 0,5 až 1 h. Táto metóda je pomerne ekonomická.

 

4. Fotochemická metóda

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 Log buniek naviazaných na HIV a krvné doštičky zostali dobré po 7 dňoch funkčnej konzervácie in vitro, čo bolo schválené FDA pre klinické skúšky.

Medzi týmito metódami je Pasteurova dezinfekčná metóda a metóda S/D schválená FDA Spojených štátov a sú vo svete široko používané. Metóda inaktivácie suchým teplom je vhodná najmä na inaktiváciu vírusov lyofilizovaných prípravkov. Fotochemická metóda má silný inaktivačný účinok na vírusy potiahnuté lipidom a v Európe sa používa na inaktiváciu vírusov v celej plazme a má široké vyhliadky na inaktiváciu vírusov v zložkách krvných buniek. Všetky tieto metódy však majú svoje nedostatky, napríklad Pasteurova sterilizácia nie je ideálna na inaktiváciu niektorých tepelne odolných vírusov; Metóda S/D nemohla účinne inaktivovať vírus nepotiahnutý lipom. Fotochemická metóda výrazne poškodila aktivitu niektorých plazmatických bielkovín. Súčasné klinické využitie následných výskumov ukazuje, že žiadna metóda inaktivácie vírusov nemôže zaručiť, že krvné produkty sú úplne bez rizika prenosu vírusov.

 

I. Proces odstraňovania vírusov

Pri výrobe krvných produktov nemôže jeden inaktivačný proces inaktivovať všetky vírusy; Okrem toho, samotný vírus je heterológny proteín, ako napríklad vstup s produktom vyvolá nepriaznivé reakcie; Zároveň, kvôli obmedzenej technickej úrovni, stále existujú vírusy, ktorých vlastnosti nie sú nájdené alebo pochopené, takže existujúce metódy inaktivácie vírusov nemôžu zaručiť inaktivačný účinok týchto vírusov. Preto samotná inaktivácia nemôže zaručiť bezpečnosť produktu a musí sa z produktu odstrániť. Technológia odstraňovania vírusov sa teda dostáva čoraz viac do pozornosti. Dva bežne používané a účinné procesy odstraňovania vírusov sú stručne opísané nižšie.

1. Chromatografická technológia

Chromatografická technológia sa týka použitia rôznych komponentov a afinity v stacionárnej fáze alebo interakčných rozdielov, aby sa dosiahlo oddelenie rôznych komponentov. Ako pokročilá technológia na výrobu krvných produktov má samotná chromatografia účinok na odstránenie vírusov, najmä afinitná chromatografia a iónomeničová chromatografia. Pre iónovo-výmennú chromatografiu má elúcia výhody oproti penetrácii pri odstraňovaní vírusov. Tabuľka 2 ukazuje štatistické údaje o rýchlosti odstraňovania HAV pomocou chromatografickej technológie v procese výroby albumínu spoločnosťou CSL Company v Austrálii. Ako je možné vidieť z tabuľky 2, iónomeničová chromatografia a gélová filtrácia sú účinnejšie pri odstraňovaní HAV s celkovou rýchlosťou odstraňovania 10,9 log.

Pri výrobe FVIII spoločnosť Baxter Healtheare vykonáva imunoafinitnú chromatografiu s použitím gélov ošetrených protilátkou anti-FVIII, ktoré dokážu odstrániť (4.2±0.1)Log a (5.3±0.9)Log z iných - vírusy potiahnuté lipidom, ako je PPV a HAV.

 

2. Filtrácia nanofilmom

Pre niektoré vírusy s malým priemerom povrchu, ako je HAV a parvovírus B19, je nanomembránová filtrácia najúčinnejšou metódou odstraňovania. Využíva rozdiel vo veľkosti medzi proteínmi a vírusmi a adsorpciu vírusov filtračnou membránou na izoláciu vírusov. Laboratórna štúdia bola vykonaná v Sanquin Blood Supply Site v Holandsku o odstraňovaní vírusov pridaním jednostupňovej, dvojstupňovej nanomembránovej filtrácie Planova 15N do procesu výroby protrombínového komplexu. Zistilo sa, že rýchlosti odstraňovania HIV, HAV a iných vírusov sa po nanomembránovej filtrácii zvýšili v rôznej miere (pozri tabuľku 3).

Pri použití tejto metódy v priemyselnej výrobe sa však môžu vyskytnúť nasledujúce problémy: Po prvé, v dôsledku vysokej viskozity produktu a prítomnosti proteínov s veľkým priemerom by veľkosť pórov membrány zvolená filtrom nemala byť príliš malá, čím sa obmedzí odstraňovanie vírusov s malým priemerom, ako je HCV; Po druhé, stabilita kontroly veľkosti pórov membrány v procese výroby filtra ovplyvní odstránenie vírusu. Po tretie, keď je membránový otvor menší ako priemer vírusovej častice zablokovaný, prietok produktu sa zníži, čo ovplyvní výťažok. Preto je výber membrán, ktorých vlastnosti a veľkosť pórov sú vhodné pre potreby spracovávaných produktov, dôležitým faktorom pri odstraňovaní vírusov pomocou nanomembránovej filtrácie.

 

3. Diskusia

V rámci predpokladu zabezpečenia kvality zdroja krvi je proces inaktivácie a odstránenia vírusu dôležitým a nevyhnutným prostriedkom na zaistenie bezpečnosti krvných produktov. Použitie iba jedného procesu inaktivovaného vírusu nemôže absolútne zaručiť bezpečnosť krvných produktov. Na základe technológie inaktivácie vírusov bola pridaná technológia odstraňovania vírusov, ako je chromatografia a filtrácia nanofilmom, výrazne sa zvýšila rýchlosť odstraňovania vírusov a výrazne sa zlepšil účinok inaktivácie a odstraňovania vírusov. V súčasnosti Európa jasne navrhla, že v procese výroby krvných produktov sa musí použiť aspoň jedna inaktivácia a odstránenie vírusov, aby sa zabezpečila bezpečnosť krvných produktov.

V Číne väčšina výrobcov krvných produktov používa vo výrobnom procese iba jeden inaktivovaný vírusový proces, ako je Pasteurova dezinfekčná metóda, S/D metóda atď., ale nepoužívajú proces odstraňovania vírusov, ktorý vážne ovplyvňuje kvalitu krvných produktov. Vstupom Číny do WTO bude výrobný proces a štandardy kvality domácich krvných produktov v súlade so svetom, inak nemôže zaručiť existujúci podiel na domácom trhu, ale ani nemôže konkurovať podobným výrobkom v iných krajinách medzinárodný trh.

Čínski výrobcovia krvných produktov preto musia zlepšiť výrobný proces, posilniť inaktiváciu a odstránenie vírusu, aby plne zabezpečili kvalitu a bezpečnosť produktu. Preto bude trendom čínskych výrobcov krvných produktov používať chromatografiu na čistenie krvných produktov a odstraňovanie vírusov, aby sa zaistila bezpečnosť krvných produktov.

 

O Guidlingu

 

Guidling Technology je národný high-tech podnik so zameraním na biofarmaceutiká, bunkovú kultúru, čistenie a koncentráciu biomedicíny, diagnostiky a priemyselných tekutín. Úspešne sme vyvinuli odstredivé filtračné zariadenia, ultrafiltračné a mikrofiltračné kazety, vírusový filter, TFF systém, hĺbkový filter, duté vlákno atď., ktoré plne spĺňajú aplikačné scenáre biofarmaceutík, bunkových kultúr atď. Naše membrány a membránové filtre sa široko používajú pri koncentrácii, extrakcii a separácii predfiltrácie, mikrofiltrácie, ultrafiltrácie a nanofiltrácie. Naše mnohé produktové rady, od malých jednorazových laboratórnych filtrácií až po výrobné filtračné systémy, testovanie sterility, fermentáciu, bunkové kultúry a ďalšie, spĺňajú potreby testovania a výroby. Guidling Technology sa teší na spoluprácu s vami!