Aký je vplyv koncentrácie vstupného materiálu na ultrafiltračné kazety?

Keď som prvýkrát začal pracovať s ultrafiltračnými (UF) kazetami v mojich začiatkoch ako dodávateľ filtrov, priznám sa, že som nad koncentráciou krmiva veľa nepremýšľal, okrem kontroly, či je roztok, ktorý spracovávam, „dostatočne hustý“. To sa rýchlo zmenilo - keď biotechnologický klient narazil na stenu s krokom koncentrácie protilátok, pričom obviňoval časté upchávanie a podivne nekonzistentné rýchlosti toku. Ukázalo sa, že tlačili oveľa viac, ako ich UF kazeta dokázala zvládnuť, a stálo ich to dni prestojov a šaržu drahého produktu. Ak pracujete s kazetami UF, nie je to len malý detail – je to jedna z najväčších pák, ktoré robia alebo narúšajú váš proces, od výťažnosti až po dobu prevádzky. Poďme si rozobrať, ako koncentrácia krmiva ovplyvňuje každú časť UF a čo som sa za tie roky naučil, aby veci fungovali hladko.

Najprv to uzemnime na tom, čo UF kazety skutočne robia, len aby sme sa uistili, že sme na rovnakej vlne. Ak ste v hre nováčikom, UF kazeta je samostatná jednotka s plochými membránami (pozrite si našePlochá kazetastrana pre úplné rozdelenie), ktorá oddeľuje molekuly podľa veľkosti – malé častice prechádzajú cez membránu, zatiaľ čo väčšie sa „zadržujú“ a sústreďujú sa na strane podávania. Prečo sú také populárne v biofarmácii, potravinách a nápojoch a odpadových vodách? Sú kompaktné, opakovane použiteľné (niekedy, ak sú správne vyčistené) a oveľa konzistentnejšie ako staršie, ručne rezané membránové zostavy. TheKazetová ultrafiltrácialinka, ktorú ponúkame, je postavená na škálovateľné série, od malých laboratórnych sérií až po úplnú výrobu, a preto sme spolupracovali s klientmi od začínajúcich biotechnológov až po globálne potravinárske značky.

Koncentrácia krmiva, pre tých, ktorí sa hlboko neponorili do terminológie, je v podstate množstvo cieľovej (alebo nechcenej) rozpustenej látky v roztoku, ktorý pumpujete do kazety. Napríklad, ak koncentrujete monoklonálne protilátky (mAb) z bujónu s bunkovou kultúrou, kŕmna koncentrácia je tu, koľko gramov mAb je na liter tohto bujónu. Nie je to len cieľ – máte tiež primiešané nečistoty, ako sú bunkové zvyšky, zložky médií a zvyšné pufrovacie soli. Sladký bod pre koncentráciu krmiva sa líši v závislosti od limitu molekulovej hmotnosti (MWCO) vašej membrány, však? 30KD UF kazeta funguje skvele pre malé proteíny, zatiaľ čo 500KD kazeta je pre väčšie molekuly, ako sú vírusové vektory. Videl som klientov, ktorí chytili prvú kazetu, na ktorú sa pozreli, bez ohľadu na koncentráciu krmiva, a tam začínajú chyby.

Začnime s najbezprostrednejším dopadom: rýchlosťou toku. Tok je objem roztoku, ktorý prejde membránou na jednotku plochy za hodinu – je to základná kosť produktivity UF. Keď je vaša koncentrácia krmiva príliš vysoká, tok klesá rýchlo a nie lineárne. Tu je dôvod, prečo: ako spracovávate roztok, zadržané rozpustené látky sa hromadia v blízkosti povrchu membrány a vytvárajú to, čo sa nazýva „koncentračná polarizačná vrstva“. Táto vrstva funguje ako dodatočná bariéra, takže voda a malé rozpustené látky musia tvrdšie pracovať, aby sa cez ňu dostali. Ak je koncentrácia krmiva na začiatku mimoriadne vysoká, táto polarizačná vrstva rýchlo zhustne a čoskoro cez ňu sotva pretlačíte nejaký permeát. Minulý rok som mal klienta, ktorý spustil 30KD ultrafiltračnú kazetu na hustom supernatante bunkovej kultúry – kŕmili 25 g/l proteínu, keď naše odporúčanie bolo 10–15 g/l. Ich prietok klesol z 60 l/m²/h na 12 l/m²/h za 2 hodiny a museli sa vypnúť, aby kazetu predčasne vyčistili, čím stratili 12 hodín prevádzky. Ešte horšie je, že vysoká koncentrácia polarizácie viedla k tomu, že niektoré proteíny uviazli v tejto vrstve, takže ich výťažok bol o 18% nižší, ako sa očakávalo.

Ale nie je to len tok – koncentrácia krmiva tiež priamo súvisí so znečistením membrány, čo je veľký boogeyman UF. Znečistenie je, keď sa rozpustené látky, úlomky alebo agregáty natrvalo prilepia na povrch membrány alebo steny pórov, a je to oveľa horšie s príliš koncentrovanými krmivami. Keď sú rozpustené látky natlačené spolu v krmive, je pravdepodobnejšie, že sa zrazia s membránou a uviaznu. V priebehu rokov som vyčistil stovky UF kaziet a v 80 % prípadov sa silné znečistenie vracalo späť ku koncentrácii krmiva, ktorá bola 2 – 3-násobok odporúčaného rozsahu. Napríklad potravinový klient, ktorý spracováva ovocné šťavy, chcel koncentrovať na 30° Brix v jednom prechode namiesto 15° Brix (čo je sladká bodka pre ich 10KD kazetu). Pektín a cukor v šťave sa začali hromadiť na membráne do 30 minút a na konci cyklu boli póry membrány čiastočne zablokované, takže dosiahli iba štvrtinu koncentrácie, ktorú očakávali, a kazetu museli vymeniť po troch cykloch namiesto 10. To prinieslo oveľa vyššie náklady na liter, ako keby koncentráciu rozdelili na dva prechody s nižšou koncentráciou prívodu zakaždým.

Výťažok je ďalšou oblasťou, kde koncentrácia krmiva tvrdo zasiahne, najmä v biofarmácii, kde záleží na každom grame produktu. Keď je vaše krmivo príliš koncentrované, nielenže sa viac znečistí, ale tiež začnete vidieť stratu produktu dvoma spôsobmi. Po prvé, koncentračná polarizačná vrstva môže zachytiť cieľové molekuly, a ak bude príliš hrubá, tieto molekuly môžu byť odnesené spolu s retentátom, keď vypustíte kazetu, namiesto toho, aby boli koncentrované. Po druhé, niektoré cieľové molekuly (napríklad proteíny) sa môžu začať agregovať pri vysokých koncentráciách a tieto agregáty sú často dostatočne malé na to, aby prekĺzli cez membránu alebo uviazli v permeáte, takže ich stratíte. Klient vírusového vektora, s ktorým som pracoval minulý rok, používal našu 500KD ultrafiltračnú kazetu na koncentrovanie AAV vektorov – posunuli koncentráciu krmiva na 1e13 vektorových genómov na ml, čo je oveľa viac ako naše odporúčanie 2e12. Ich výťažok bol len 45% oproti 82%, ktoré získali, keď znížili koncentráciu krmiva na správny rozsah. Keď sme testovali retentát, zistili sme, že 30 % ich cieľového vektora uviazlo v koncentračnej polarizačnej vrstve a ďalších 15 % sa agregovalo a stratilo. To je druh zásahu, ktorý môže spôsobiť, že celá šarža bude bezcenná, najmä ak máte čo do činenia s procesmi v súlade s GMP, kde nemôžete vyrobiť viac produktov len tak z rozmaru.

Počkajte, ale predtým, než si budete myslieť, že „nižšia koncentrácia krmiva je vždy lepšia“ – ani to nie je pravda. Ak je váš prívod príliš zriedený, strácate čas a kapacitu kazety. UF je najefektívnejšie, keď koncentrujete roztok na primeranú úroveň, ale ak začnete s príliš tenkým krmivom, pohybujete sa oveľa väčším objemom, než potrebujete, čo zvyšuje náklady na energiu na čerpanie a trvá dlhšie, kým sa dostanete na cieľovú koncentráciu. Napríklad laboratórny klient, ktorý koncentroval malú vzorku proteínu, používal 10KD kazetu s koncentráciou prívodu 0,1 mg/ml – pokúšali sa dostať na 10 mg/ml, takže spracovávali 100 ml roztoku, aby získali 10 ml retentátu. Trvalo im to 8 hodín v porovnaní s 2 hodinami, keď koncentrovali krmivo najprv centrifugáciou na 0,5 mg/ml, takže spracovali len 20 ml. To je obrovský rozdiel v práci a čase, najmä ak spúšťate viacero dávok denne. Kľúčom je zasiahnuť tento stredný rozsah – to, čo nazývam „okno koncentrácie“ pre vašu konkrétnu kazetu a aplikáciu.

Ako teda zistíte to okno koncentrácie? Nie je to univerzálne riešenie, ale existuje niekoľko základných pravidiel, ktoré zdieľame so všetkými našimi klientmi. Najprv skontrolujte MWCO kazety: kazeta s vyšším MWCO (napríklad 500 kD) zvyčajne zvládne vyššiu koncentráciu prívodu ako nižšia MWCO (napríklad 30 kD), pretože póry sú väčšie, takže polarizácia je menší problém. nášKazety-TFF-filtračná sériastrana má špecifické rozsahy koncentrácií pre každú kazetu, ale vo všeobecnosti nikdy neprekračujte 10–15 % celkových tuhých látok pre väčšinu proteínových aplikácií a 5–10 % pre malé molekuly. Po druhé, otestujte svoje krmivo na nečistoty: ak má krmivo veľa nečistôt alebo agregátov, potrebujete nižšiu koncentráciu krmiva, aby ste sa vyhli znečisteniu, bez ohľadu na to, aká je vaša cieľová molekula. Po tretie, najskôr vykonajte testy v malom meradle – nevrhnite sa len na plnú produkciu. Test s objemom 100 ml alebo 1 l vám presne povie, aké tavidlo dosiahnete, ako rýchlo dôjde k znečisteniu a akú výťažnosť môžete očakávať, aby ste neplytvali cenným produktom.

Ďalšia vec, ktorú som si všimol v priebehu rokov, je, že koncentrácia krmiva interaguje s inými parametrami procesu, ako je rýchlosť krížového prietoku a transmembránový tlak (TMP). Nie je to ako nastavovanie koncentrácie vo vákuu – ak máte vysokú koncentráciu prívodu, môžete to trochu kompenzovať zvýšením rýchlosti krížového prietoku, ktorý zmetie polarizačnú vrstvu preč od povrchu membrány, a zvýšením TMP (ale nie príliš, pretože TMP môže spôsobiť zhutnenie polarizačnej vrstvy). Ale toto je vyváženie: vyšší crossflow znamená viac energie a vyšší TMP môže viesť k poškodeniu membrány, ak si nedáte pozor. Klientom vždy odporúčame, aby spustili testy s úplnými parametrami, ktoré zahŕňajú koncentráciu krmiva, pretože zmena jedného môže vyhodiť ostatné. Napríklad klient sa raz pokúsil opraviť pokles toku z vysokej koncentrácie krmiva naštartovaním TMP a skončilo to tak, že zhutnil membránu, takže ich ďalšie behy mali ešte nižší tok. To je dôvod, prečo v našej spoločnosti nepredávame len kazety – pomáhame našim klientom prechádzať týmito procesmi, pretože sme videli takmer každú chybu, ktorú môžete pri koncentrácii krmiva urobiť.

Hovorme aj o dlhodobých účinkoch, pretože koncentrácia krmiva neovplyvňuje len jeden chod – ovplyvňuje životnosť kazety. Ak beháte s príliš koncentrovaným krmivom, vytvárate oveľa viac znečistenia, čo znamená, že musíte kazetu čistiť častejšie a agresívnejšie čistiace prostriedky (napríklad vyššie pH alebo teplota), aby ste sa zbavili nánosov. Toto agresívne čistenie časom membránu znehodnotí, takže kazeta má v sebe menej chodov, kým ju treba vymeniť. Mal som klienta, ktorý používal našu plochú kazetu a pri piatom spustení ju museli vymeniť kvôli silnému znečisteniu, zatiaľ čo iný klient, ktorý používal rovnakú kazetu so správnou koncentráciou podávania, mal viac ako 15 cyklov. To je obrovský rozdiel v nákladoch, keď prechádzate kazetami každý týždeň v porovnaní s každým mesiacom.

Teraz poďme prakticky – čo by ste vlastne mali robiť, ak je vaša koncentrácia krmiva vypnutá? Najprv si to poriadne zmerajte. Veľa klientov sa riadi „vizuálnou hrúbkou“ riešenia, čo je veľmi nepresné. Na získanie presnej koncentrácie použite Brix meter pre potravinárske produkty alebo absorbanciu (ako A280 pre bielkoviny). Potom upravte krmivo buď jeho zriedením (ak je príliš vysoké), alebo jeho ďalším zahustením pomocou menšieho kroku predbežného spracovania (ako je filtrácia s tangenciálnym prietokom s inou kazetou alebo odstreďovanie), ak je príliš nízke. Ak máte čo do činenia s jedinečným krmivom, napríklad vlastným biologickým prípravkom, obráťte sa na náš tím – máme špecialistov na aplikácie, ktorí vám môžu pomôcť navrhnúť proces prispôsobený koncentrácii vášho krmiva, či už ide o výber správneho MWCO (napríklad 30 kD vs. 500 kD), úpravu krížového toku alebo určenie najlepšej doby chodu.

Nemôžem dostatočne zdôrazniť, ako veľmi malé vylepšenia na zvýšenie koncentrácie môžu zmeniť celý váš proces UF. Nie je to nudný detail – je to rozdiel medzi behom, ktorý zasiahne všetky vaše ciele týkajúce sa výnosov a časových plánov, a behom, ktorý vás nechá niekoľko dní riešiť problémy, plytváte produktom a peniazmi. Postavili sme si svojeKazetová ultrafiltráciaaby bola línia flexibilná, s možnosťami pre rôzne MWCO (ako je naša30kD ultrafiltračné kazetya500KD ultrafiltračné kazety), návrhy plochých listov a nastavenia série TFF, pretože vieme, že informačný kanál každého klienta je iný. Ak zápasíte s problémami s koncentráciou krmiva alebo len chcete zefektívniť proces UF, sme tu, aby sme vám pomohli – spolupracovali sme s tisíckami klientov, aby sme dosiahli správne okná koncentrácie a môžeme urobiť to isté pre vás. Nedovoľte malým detailom, ako je koncentrácia krmiva, zničiť vaše behy – obráťte sa na náš tím, aby ste sa dozvedeli viac o optimalizácii vášho procesu ešte dnes.

Referencie

1. Belfort, G., Davis, RH, & Zydney, AL (1994). Správanie sa suspenzií a makromolekulárnych roztokov pri mikrofiltrácii s priečnym tokom. Journal of Membrane Science, 96 (1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Hydrodynamická a koncentračná polarizácia pri ultrafiltrácii: Prehľad. Odsoľovanie, 211 (1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Tangenciálna prietoková filtrácia pre biofarmaceutické spracovanie. Current Opinion in Chemical Engineering, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Základné princípy membránovej technológie (2. vydanie). Kluwer Academic Publishers.