Koncentračný proces ultrafiltrácie/diafiltrácie po prúde: Ako účinne zabrániť prenikaniu a strate cieľového proteínu
Proces koncentrácie ultrafiltrácie / diafiltrácie po prúde: Ako účinne zabrániť prenikaniu a strate cieľového proteínu
V následných purifikačných procesoch pre rekombinantné proteíny, krvné produkty a iné biologické látky sa ultrafiltrácia/diafiltrácia (UF/DF) používa na koncentráciu suroviny, výmenu pufra a odstránenie solí a malých-molekulových nečistôt. Separácia sa dosahuje na základe membránového preosievania: veľké molekuly, ako sú monoklonálne protilátky (mAb), sú zadržané membránou, zatiaľ čo soli, endotoxíny, voľné proteíny hostiteľských buniek (HCP) a iné malé -molekulové nečistoty prechádzajú cez membránu a sú odstránené v permeáte. Počas zvyšovania-procesu môže ľahko dôjsť k cieľovej strate bielkovín cez membránu, čo priamo zníži výťažok a zvýši náklady na šaržu. V niektorých prevádzkových podmienkach môže byť proteín detegovaný v permeáte, čo si vyžaduje rýchle určenie, či uniknuté zložky sú intaktná cieľová mAb, degradované/fragmentované agregáty alebo proteíny hostiteľskej bunky. Tento článok je rozdelený do dvoch hlavných častí: skúma tradičné postupy-kontrolných prístupov a v kombinácii s návrhom experimentov (DOE) vytvára robustné procesné okno podporované viacerými analytickými metódami na určenie identity proteínov zistených v permeáte.
I. Kľúčové príčiny permeácie cieľového proteínu cez membránu počas UF/DF
1. Nadmerný transmembránový tlak (TMP)
Keď je tlakový rozdiel cez membránu príliš vysoký, zvýši sa odpor rozpúšťadla, čím sa do permeátu vtlačí určitý monomérny proteín. Počas zväčšovania-napájacej nádrže obsahuje väčší objem materiálu a kolísanie tlaku v potrubí je výraznejšie, takže prechodný pretlak je pravdepodobnejší ako v laboratórnom meradle.
2. Nesprávny tangenciálny prietok
Ak je prietok príliš nízky, na povrchu membrány sa vytvorí hustá koncentračná-polarizačná vrstva a lokálna koncentrácia proteínu môže prekročiť prah tolerancie membrány. Ak je prietok príliš vysoký, šmykové napätie môže spôsobiť štrukturálne štiepenie mAb, čím sa generujú menšie proteínové fragmenty, ktoré môžu voľne prechádzať cez membránové póry.
3. Príliš vysoká koncentrácia bielkovín v surovine
Keď je koncentrácia proteínu v krmive príliš vysoká, proteín sa hromadí na povrchu membrány a časť monomérneho proteínu sa môže dostať do permeátu. Ide o bežný problém vo-výrobe vo veľkom meradle.
4. pH alebo vodivosť mimo rozsahu procesu
Zmeny v nábojových charakteristikách proteínu môžu znížiť jeho hydratačný polomer a zdanlivú veľkosť častíc, čo vedie k abnormálnej membránovej permeácii.
5. Starnutie membránovej kazety, vysoký difúzny tok alebo nedostatočná pred-kondicionácia
Fyzické defekty v membránovej kazete môžu priamo spôsobiť únik proteínu a predstavovať-riziko súvisiace so zariadením. Opakovaný CIP so silne alkalickými roztokmi môže postupne poškodiť materiál polyétersulfónovej (PES) membrány.
6. Nadmerný objem diafiltrácie
Počas dlhšej diafiltrácie môže kontinuálne preplachovanie rozpúšťadlom postupne odnášať malé množstvá monomérneho proteínu.
II. Tradičné praktické opatrenia na zabránenie prenikaniu a strate cieľových bielkovín
(A) Kontrola parametrov procesu
1. Kontrola transmembránového tlaku (TMP)
Definujte horný tlakový varovný limit a vytvorte blokovacie alarmy, aby ste zabránili prechodným vplyvom vysokého{0}}tlaku na membránovú vrstvu. Po určení základných parametrov v malom rozsahu znížte bezpečný prevádzkový tlak počas-zvýšenia výroby a vyhraďte si vhodný rozsah tolerancie procesu.
2. Optimalizujte rýchlosť priečneho toku
Vytvorte stabilnú hraničnú vrstvu a znížte koncentračnú polarizáciu na povrchu membrány krížovým tokom, čím sa minimalizuje akumulácia proteínu na povrchu membrány pri zdroji.
3. Po koncentrácii obmedzte konečnú koncentráciu
Definujte koncentračný limit na základe fyzikálno-chemických vlastností proteínu a vyhnite sa nadmernej koncentrácii krmiva. Pre mAb rutinná konečná koncentrácia všeobecne nepresahuje 50 mg/ml; pre niektoré mAbs náchylné na agregáciu- by sa koncentrácia mala ďalej znižovať.
4. Kontrolujte pH a vodivosť krmiva
Udržujte stabilnú veľkosť hydratovaných častíc proteínu a vyhýbajte sa molekulárnej kontrakcii spôsobenej acidobázickou alebo iónovou -poruchou sily.
(B) Vybavenie a ovládacie prvky
1. Pred každou dávkou vykonajte test integrity membránovej kazety
Pred výrobou každej šarže vykonajte bublinový-test, aby ste identifikovali zlomené membránové vlákna. Poškodené membránové kazety by sa mali okamžite zlikvidovať, aby sa zabránilo nepretržitému úniku bielkovín.
2. Štandardizujte postup čistenia CIP
Kontrolujte koncentráciu NaOH a čas kontaktu. Po silne alkalickom čistení úplne ekvilibrujte materiál membrány, aby ste znížili riziko deformácie pórov membrány.
3. Použite postupnú diafiltráciu
Počas počiatočného štádia použite veľkú{0}}objemovú výmenu pufra na odstránenie solí a spomalte prietok diafiltrácie, keď sa blíži koncový bod, aby ste znížili unášanie a stratu proteínu.
III. Vytvorenie priestoru návrhu procesu prostredníctvom DOE (QbD Process Characterization; použiteľné pre IND Submission)
1. Skríning faktorov
Preverte päť kľúčových parametrov procesu UF/DF (P): transmembránový tlak, prietok krmiva, počiatočnú koncentráciu proteínu, pH krmiva a prevádzkovú teplotu.
Premenné odozvy: zadržaný výťažok, obsah bielkovín v permeáte, membránový tok a percento agregátov s vysokou -molekulárnou-hmotnosťou.
Prostredníctvom analýzy významnosti identifikujte kľúčové faktory, ktoré prispievajú k úniku bielkovín.
2. Modelovanie povrchu odozvy
Vyberte štyri parametre s najvyššou významnosťou na vytvorenie povrchu odozvy a analýzu interakcií medzi parametrami. Pri mnohých prevádzkových podmienkach môže jeden parameter zostať v kvalifikovanom rozsahu, zatiaľ čo kombinácia dvoch parametrov môže viesť k prestupu proteínu. Takéto interakcie nie je možné identifikovať prostredníctvom tradičných-faktorových-experimentov--v danom čase. Na základe modelu definujte funkčný dizajnový priestor. Pokiaľ parametre procesu zostanú v tomto rozsahu, môže byť zaistená účinná retencia proteínu, zatiaľ čo nečistoty sú odstránené diafiltráciou.
3. Najhorší-prípad (vyžaduje sa na charakterizáciu procesu)
Vyberte parametre procesu na extrémoch prevádzkových hraníc na simuláciu výrobnej variability: maximálny TMP, minimálna rýchlosť krížového prietoku a horná-medzná koncentrácia proteínu. Overte si, že ani za extrémnych prevádzkových podmienok nedochádza k veľkým-stratám cieľových bielkovín, čím sú splnené požiadavky na kontrolu CMC.
IV. Viaceré analytické metódy na identifikáciu proteínov zistených v permeáte a na rozlíšenie cieľovej mAb, degradačných fragmentov a HCP
Na základe analytickej účinnosti, nákladov a regulačných scenárov predloženia možno metódy rozdeliť do dvoch kategórií: rýchly skríning a potvrdzujúce testovanie. Pri rutinnom monitorovaní procesu by sa mali uprednostniť rýchle metódy; keď sa vyskytnú abnormálne odchýlky, mali by sa použiť presné metódy identifikácie.
1. UV spektrofotometria (rýchle online skríning; uprednostňuje sa pre bežné{1}}monitorovanie podlahy v obchode)
Zozbierajte permeát a zmerajte jeho absorbanciu A280. To môže určiť iba to, či je proteín prítomný v permeáte a nemôže rozlíšiť druhy proteínov. Používa sa hlavne na rutinné monitorovanie procesov. Neustále sa zvyšujúca hodnota A280 indikuje zhoršujúci sa únik proteínu a vyžaduje okamžité pozastavenie diafiltrácie a vyšetrenie procesu.
2. Elektroforéza SDS-PAGE (najbežnejšie používaná metóda kvalitatívnej identifikácie)
Použite redukčnú a neredukčnú -elektroforézu a porovnajte polohy pásov s polohami cieľovej mAb vo východiskovej surovine:
1) Ak je poloha pásu úplne konzistentná s cieľovou mAb, intaktná mAb prenikla cez membránu.
2) Ak sa objavia pásy s nižšou -molekulovou- hmotnosťou, proteín prešiel hydrolytickým štiepením, čím sa vytvorili fragmenty mAb.
3) Ak sú pásy rozptýlené s viacerými rôznymi pásmi, väčšinou ide o proteíny hostiteľských buniek (HCP) z hostiteľských buniek E. coli/CHO, a nie o cieľový produkt.
3. Vylučovacia chromatografia s vysokou-veľkosťou-(HPSEC)
Oddeľte zložky podľa veľkosti molekuly a porovnajte ich elučné časy s časmi chromatogramu suroviny:
- Hlavný pík s rovnakým retenčným časom ako mAb označuje intaktný cieľový proteín.
- Vrchol eluujúci skôr označuje agregáty/fragmenty s vysokou -molekulárnou-hmotnosťou.
- Pík eluujúci neskôr označuje fragmenty degradácie s nízkou -molekulárnou- hmotnosťou.
- Neprítomnosť charakteristického hlavného píku označuje proteíny nečistôt HCP.
Táto metóda môže poskytnúť kvantitatívne údaje a môže byť zahrnutá do správ o vyšetrovaní odchýlok procesu; má vysokú akceptáciu v materiáloch na klinické predkladanie.
4. Testovanie súpravy ELISA na proteín hostiteľskej bunky HCP{1}}
Ak sa v permeáte deteguje proteín, výsledok testu ELISA je zvýšený a HPSEC nevykazuje žiadny charakteristický pík mAb, možno v podstate určiť, že uniknutý materiál sú proteíny hostiteľských buniek- CHO. To naznačuje neúplné odstránenie nečistôt počas čistenia pred prúdom; nečistoty sa vymývajú počas fázy UF/DF a nepredstavujú stratu produktu.
5. Overenie afinitnou chromatografiou (chromatografia s proteínom A)
Proteín A špecificky viaže Fc oblasť mAb. Naneste vzorku permeátu na kolónu: výskyt charakteristického elučného píku indikuje prítomnosť intaktnej cieľovej protilátky; neprítomnosť elučného píku ukazuje, že proteíny v permeáte sú všetky proteíny nečistôt.
6. Hmotnostná spektrometria (LC-MS) (v-hĺbkovej sledovateľnosti; používa sa na skúmanie veľkých odchýlok procesu)
LC-MS dokáže priamo analyzovať sekvenciu aminokyselín a presne určiť pôvod proteínu. Používa sa hlavne na skúmanie zložitých alebo neobvyklých odchýlok a nepoužíva sa ako rutinný-test kontroly procesu.
V. Nápravné opatrenia zodpovedajúce rôznym analytickým výsledkom
1. Neporušená cieľová mAb detegovaná v permeáte
Znížte transmembránový tlak a konečnú koncentráciu po koncentrácii; zúžiť prevádzkový rozsah procesu na základe výsledkov DOE; a skontrolujte integritu membránovej kazety.
2. Fragmenty degradácie protilátok detegované v permeáte
Preskúmajte šmykové napätie počas procesu a extrémy pH; optimalizovať krok inaktivácie vírusu proti smeru, aby sa znížilo štiepenie proteínu.
3. V permeáte detegované len proteíny nečistôt HCP
Nevyžaduje sa žiadna úprava parametrov UF/DF. Vysledujte problém späť k predchádzajúcim krokom chromatografie a zlepšite odstraňovanie nečistôt počas afinitnej a iónomeničovej -chromatografie.
VI. Zhrnutie
Aby sa predišlo úniku bielkovín počas UF/DF, tradičné riadenie procesu sa pri definovaní individuálnych bodových parametrov spolieha na historické skúsenosti, ktoré môžu adekvátne riešiť iba stabilnú-výrobu v malom meradle. Na zabezpečenie stabilného výkonu pri postupnom zvyšovaní-procesu by sa mala na vytvorenie priestoru návrhu procesu s dostatočnou toleranciou použiť charakterizácia procesov založená na DOE-. Intervalové-riadenie parametrov môže kompenzovať variabilitu výroby. Po detekcii proteínu v permeáte môže jednoduchý UV detekčný systém poskytnúť počiatočné varovanie, po ktorom nasleduje elektroforéza, HPSEC a ELISA na sledovateľnosť a identifikáciu. To umožňuje presné rozlíšenie medzi cieľovým produktom a nečistotami hostiteľských-buniek, čo umožňuje cielené skúmanie koreňovej-príčiny a nápravné opatrenia. Toto je tiež štandardizovaný komponent výskumu, ktorý je v súčasnosti zahrnutý v dokumentácii CMC pre projekty mAb.
