Podiel literatúry Rozlúčiť sa s komplexným čistením? Nová metóda TFF + povrchovo aktívna látka zlepšuje účinnosť a znižuje náklady vo výrobe vektorov AAV

Génová terapia sa rýchlo vyvíja, ale jej vysoké náklady zostávajú hlavnou bariérou, ktorá bráni širšiemu prístupu pacientov. Medzi kľúčové hnacie sily týchto nákladov patrí komplexný výrobný proces vektorov adeno -. Štúdia publikovaná v biotechnológii a bioinžinierstve vyvinula novú metódu čistenia kombinujúcej filtráciu tangenciálneho toku (TFF) s povrchovo aktívnymi látkami, ktorá sľubuje zjednodušenie procesu čistenia AAV a znížiť náklady. Poďme sa ponoriť do tohto výskumu vedeného tímom z University of Tokio.

 

1. Výskumné pozadie: Výzvy a súčasný stav čistenia AAV

Vektory AAV sa stali „nástrojmi na dodávanie hviezd“ v génovej terapii v dôsledku ich vysokej bezpečnosti, nízkej imunogenity, schopnosti infikovať deliace aj ne {{}} deliace bunky a kapacitu pre dlhú - termín génovú expresiu. Ich výrobný proces je však komplexný, najmä kroky dole na čistenie, ktoré zvyčajne zahŕňajú viacero kôl odstredivka a chromatografie. Tieto metódy sú čas - náročné, práca - intenzívne, ťažko škálovateľné a nákladné.

V laboratórnom meradle sa čistenie často spolieha na ultracentrifugáciu gradientu hustoty cesium alebo jodixanol hustoty, ktorá je náročná na mierku priemyselnej výroby. Afinitná chromatografia sa stále viac používa, ale nízke podmienky elúcie pH, ktoré vyžaduje, môžu zhoršiť vírusovú infekčnosť. Preto je rozhodujúci vývoj jednoduchej, efektívnej, jemnej a škálovateľnej metódy čistenia AAV.

Filtrácia tangenciálneho toku (TFF) je veľkosť separačnej techniky založenej na veľkosti -, ktorá sa bežne používa na koncentráciu a vyrovnávaciu pamäť - výmenu bioproduktov. Konvenčná TFF má však obmedzenú schopnosť odstraňovať nečistoty, ako sú proteíny hostiteľských buniek (HCP) a DNA počas čistenia AAV, pričom proteínové agregáty často ponechávajú za sebou.

 

2. Inovatívny prístup: TFF v kombinácii s povrchovo aktívnymi látkami na efektívne čistenie

Na prekonanie obmedzení tradičných TFF vymysleli vedci Rimi Miyaoka, Yuji Tsunekawa a kolegov z Tokijskej univerzity šikovnú stratégiu: pomocou povrchovo aktívnych látok na inhibíciu agregácie a interakcie s nečistotskými proteínmi, ktoré im umožňujú prejsť cez aaafové čelné čelné časti (500 KDA MOLECULACULACE MOLECFOFS ALECLOFS ALECLOF) veľkosť nm).

Testovali tri typy povrchovo aktívnych látok:

• Non - ionic:Oktyl glukozid
• Anión:Deoxycholát sodný
• Zwitterionic:Šatka

Štúdia zistila, že s použitím ne - iónového povrchovo aktívneho látky bolo neúčinné. Aniónový deoxycholát sodný aj zwitteriónové chaps významne zvýšili odstránenie zvyškových proteínov a zamerali sa na rôzne proteínové populácie. V konečnom dôsledku kombinácia 0,5% deoxycholátu sodného s 1% CHAP priniesla pozoruhodné výsledky, čo takmer úplne eliminovalo zvyškové hostiteľské proteíny. SDS - analýza stránky ukázala iba tri priehľadné proteínové pásma AAV (VP1/VP2/VP3).

 

Obrázok 1. Proces čistenia TFF bez povrchovo aktívnych látok;(a) SDS - gélová elektroforéza; b) transmisná elektrónová mikroskopia (TEM)

 

Obrázok 1. Proces čistenia TFF s povrchovo aktívnymi látkami;(a) SDS - gélová elektroforéza; (b) prenosová elektrónová mikroskopia (TEM)

 

3. Výsledky výskumu: vysoká čistota, aktivita a bezpečnosť

1. Efektívne odstránenie nečistoty:Nová metóda dosiahla 99,98% odstránenie HCP a 95% odstránenie DNA, pričom čistota bola porovnateľná s alebo presiahla afinitná chromatografia.
2. Vylepšená infekčnosť:Experimenty in vitro ukázali, že vektory AAV1 purifikované pomocou tejto metódy infikované bunky HEK293 účinnejšie ako tie, ktoré sa čistili afinitnou chromatografiou (24,9% oproti 20,8%), čo naznačuje lepšiu konzerváciu vírusovej bioaktivity.
3. Dobrá bezpečnosť in vivo:Po lokálnom injekcii purifikovaných vektorov AAV1 do kostrového svalu myši sa po dvoch týždňoch nepozoroval významný zápal ani poškodenie tkaniva, čo dokazuje dobrú bezpečnosť in vivo.
4. Široká použiteľnosť sérotypu:Metóda úspešne vyčistila viac sérotypov - vrátane supernatantov AAV1, AAV5, AAV8 a AAV9-FROM. Avšak pre AAV2, ktorý existuje hlavne v bunkových lyzátoch s vysokým zaťažením nečistoty, je potrebná ďalšia optimalizácia.

 

4. Zhrnutie a výhľad

Táto štúdia vyvinula jednoduchý, rýchly (1,5 hodiny), efektívny a škálovateľný nový proces čistenia AAV. Kombináciou deoxycholátu sodného a CHAPS sa úspešne zaoberala výzvou zvyškovej agregácie proteínov počas čistenia TFF.

Výhody metódy zahŕňajú:

• Vyhýbanie sa tvrdým nízkym pH podmienkam, lepšiemu zachovaniu vírusovej aktivity
• Zníženie krokov chromatografie, zjednodušenie pracovného toku a šetrenie času a nákladov
• Ľahko škálovateľné, vhodné pre priemyselné veľké - Scale Production
• Poskytnutie novej stratégie na čistenie ďalších biomakromolekulov, ako sú exozómy, iné vírusy a rekombinantné protilátky

Súčasné obmedzenia zahŕňajú suboptimálne regeneráciu vírusu a neschopnosť oddeliť prázdne kapsidy od úplných vírusových častíc, čo naznačuje, že jeho najlepšie použitie môže byť ako prvé - krok zachytenia v multi - pracovný tok čistenia kroku.

Záverom je, že tento výskum ponúka atraktívnu novú možnosť pre následnú výrobu vektorov AAV a má potenciál významne znížiť náklady na lieky na génovú terapiu, čo uľahčuje ich širšiu aplikáciu.