Stručná diskusia o niekoľkých jedinečných metódach čistenia dutých vlákien pri inklúznych bodoch

Inklúzne telieska (IB) sú nerozpustné proteínové častice s vysokou hustotou zabalené do membrán vytvorených pri expresii cudzích génov v prokaryotických bunkách, najmä v Escherichia coli. Pri pozorovaní pod mikroskopom je IB oblasť s vysokým lomom, ktorá sa zjavne líši od ostatných zložiek v cytoplazme.

Tvorba inklúznych teliesok je relatívne zložitá, súvisí s rýchlosťou produkcie proteínu v cytoplazme, koncentrácia novo vytvorených peptidov je vysoká a nie je dostatok času na poskladanie, aby sa vytvorili amorfné proteínové agregáty. Inklúzne telieska sa v podstate skladajú z proteínov, z ktorých viac ako 50 % tvoria klonované produkty. Primárna štruktúra týchto produktov je úplne správna, ale trojrozmerná konfigurácia je nesprávna, takže neexistuje žiadna biologická aktivita. Veľkosť inklúzneho telieska je 0.5-1μm, nerozpustná vo vode, rozpustná iba v denaturačných látkach, ako je močovina, guanidín hydrochlorid atď.

V E. coli sa inklúzne telieska môžu vyskytovať na dvoch miestach bunky: cytoplazme a periférnej cytoplazme. Umiestnenie a charakteristiky inklúznych teliesok v bunke závisia od toho, ako sú proteíny exprimované.

Inklúzie v cytoplazme E. coli sa vo všeobecnosti pohybujú v priemere od {{0}}.2 do 1,5 μm a rôzne proteíny majú rôzne priemery, ako napríklad veľkosť interferónu je 0,811 μm a veľkosť prorennet je 1,281 μm. V niektorých prípadoch je priemer niektorých inklúznych teliesok väčší ako priemer E. coli, čo dáva E. coli výčnelok. Vo všeobecnosti má bunka iba jedno inklúzne telo.

 

Čistenie inklúznych teliesok

 

Proces čistenia inklúznych teliesok je vo všeobecnosti:

Drvenie buniek:

Všeobecná technológia drvenia buniek je: vysokorýchlostné drvenie tkaniva, homogenizácia skleným homogenizátorom, ultrazvukové ošetrenie, metóda opakovaného zmrazovania a rozmrazovania, chemické ošetrenie (vo všeobecnosti s použitím lyzozýmu).

 

Umývanie inklúznych teliesok:

Inklúzne telieska sú neaktívne pevné častice vytvorené intracelulárnou aglutináciou proteínov exprimovaných baktériami, ktoré zvyčajne existujú v amorfnej, nerozpustnej forme. V inklúznom teliesku tvorí skutočný cieľový proteín len asi 50 % a zvyšok obsahuje lipidy, lipopolysacharidy, nukleové kyseliny a heteroproteíny, ktoré sú naviazané na inklúzne telieska a ovplyvňujú renaturáciu proteínu inklúznych teliesok. Preto je umývanie pred denaturáciou veľmi potrebným krokom.

Okrem toho premývanie inklúznych teliesok pomáha zvýšiť výťažok opätovného skladania rekombinantných proteínov. Odstránením nečistôt sa môžu obmedziť prekážky v procese renaturácie, takže proteín sa môže efektívnejšie zložiť a správne zostaviť, čím sa zlepší aktivita a funkcia proteínu‌.

Pri praní sa bežne používa menej ako 1 % neutrálneho pracieho prostriedku, ako je Tween, Triton, Urea a NP40 plus EDTA a redukčné činidlá 2-merkaptotreitol (DTT), -merkaptoetanol, ktoré sa mnohokrát opakujú, pretože kapacita prania detergentu je zvýšená zvýšenie iónovej sily roztoku, pri premývaní inklúznych teliesok možno pridať NaCl na zvýšenie iónovej sily.

Inklúzne telieska sa môžu použiť na odstránenie iných zložiek roztoku na rozpad buniek centrifugáciou alebo filtráciou, pričom obe tieto telieska využívajú rôzne fyzikálne vlastnosti inklúznych teliesok.

 

Odstreďovanie:

Proteíny inklúznych teliesok sú oveľa hustejšie ako rovnaký objem bunkových fragmentov, takže inklúzne telieska môžu byť oddelené od zvyšku bunky pomocou centrifugácie. Kontinuálna centrifugácia je najčastejšie používaná operácia na získanie inklúznych teliesok v priemyselnej výrobe. Pretože hustota bunkových fragmentov je menšia ako hustota inklúzneho telieska, rýchlosť sedimentácie je menšia ako hustota inklúzneho telieska. Kontinuálna suspenzia a centrifugácia môže odstrediť väčšinu inklúzneho telieska, pričom sa postupne odstraňujú fragmenty buniek.
Filtrácia (filtrácia s tangenciálnym prietokom): Vzhľadom na rozdielne veľkosti molekúl inklúznych teliesok a rozpustných proteínov je možné použiť metódu filtrácie, ktorá môže znížiť prevádzkové náklady a zjednodušiť škálovanie. Tangenciálna prietoková filtrácia (TFF) je riadená transmembránovým tlakovým rozdielom. Látky a nečistoty menšie ako veľkosť pórov membrány prechádzajú cez membránu, zatiaľ čo nečistoty ako bunky s väčšími časticami sa zachytávajú. Membránový otvor všeobecne používaný na premývanie filtráciou je 0,1μm. Mikrofiltrácia s tangenciálnym tokom dutého vlákna sa môže priamo vysporiadať s vysokým obsahom tuhých látok v tekutom materiáli, menším počtom krokov, jednoduchou obsluhou, membránu možno opakovane používať čistením, čím sa znižujú investície do zariadenia a prevádzkové náklady, v súlade s požiadavkami modulárnej automatizovanej výroby.

 

Nasleduje príklad aplikácie pre umývanie inklúznych teliesok pomocou vodiacich kolón s dutými vláknami.

Použili sme 94 cm2 0.1-0.45μm duté vlákno na zahustenie 250 ml tekutiny (molekulová hmotnosť cieľového proteínu 17 kd). V celom premývacom procese sa skúmala rýchlosť obnovy cieľového proteínu a vyčerpanie membránového toku.

0-71min je proces koncentrácie, 71-224min je proces premývania a filtrácie. Počas celého procesu mikrofiltrácie sa TMP postupne zvyšoval, rýchlosť vstupu kvapaliny zostala nezmenená a priemerný tok materiálu bol 12 LMH.

Výsledky ukázali, že cieľový proteín bol úplne zachytený a miera regenerácie cieľového proteínu bola viac ako 90 %. Vodiace stĺpy z dutých vlákien sú stabilné a vhodné pre túto aplikáciu.

 

Rozpustenie inklúzneho telieska:

Inklúzne telieska sú vo všeobecnosti rozpustené v podmienkach denaturačného činidla močoviny alebo guanidín hydrochloridu a rozpustené proteíny inklúznych teliesok sú úplne denaturované, to znamená, že okrem primárnej štruktúry a kovalentných väzieb sú zachované všetky vodíkové väzby a hydrofóbne väzby sú zničené a hydrofóbne bočné reťazce sú úplne odkryté.

Močovina a guanidín hydrochlorid sú stredne silné denaturanty, ktoré sa ľahko odstraňujú dialýzou a ultrafiltráciou. Všeobecná koncentrácia močoviny 8-10M, hydrochlorid guanidínu 6-8M. Rozpúšťanie močoviny má výhody neionizácie, je neutrálne, má nízku cenu, odstránenie proteínu po renaturácii nespôsobí veľké množstvo precipitácie proteínu a rozpustené inklúzne telieska možno čistiť rôznymi chromatografickými metódami, takže sa široko používa .

 

Refolding proteínov inklúznych teliesok:

Rozpustený rekombinantný proteín musí byť správne zložený, aby sa vytvoril funkčný proteín. Techniky renaturácie zahŕňajú riedenie proteínového roztoku takmer na neutrálnu úroveň, odstránenie denaturačného činidla, renaturáciu na kolóne a gélovú filtračnú chromatografiu. Spomedzi nich je riedenie proteínového roztoku na takmer neutrálnu a odstránenie denaturačného činidla bežnou klasickou metódou renaturácie, najmä metóda renaturácie zriedením má najvyššiu mieru využitia.

Odstránenie denaturačného činidla:

Dialýza: Výhodou je, že objem sa nezväčšuje a rýchlosť odstraňovania denaturantu je riadená postupným znižovaním koncentrácie vonkajšej priepustnej kvapaliny, ale trvá to dlho a ľahko sa tvoria neaktívne proteínové agregáty, čo nie je vhodné pre vo veľkom meradle a nie je možné ho použiť vo výrobnom meradle.

Ultrafiltrácia (TFF): jednoduché ovládanie rýchlosti dialýzy, či už vo výskume a vývoji, pilotnom teste alebo výrobe, dokáže odstrániť denaturačné látky (výmena kvapaliny + koncentrácia) pomocou ultrafiltrácie (TFF).

 

Čistenie proteínov inklúznych teliesok:

Metódy purifikácie proteínov po renaturácii sú podobné ako metódy purifikácie rozpustných proteínov, menovite iónomeničová chromatografia, gélová filtračná chromatografia, afinitná chromatografia, precipitácia síranom amónnym atď.

Inklúzne telieska nemajú žiadnu biologickú aktivitu, nie je potrebné sa obávať straty proteínovej aktivity a veľké množstvá expresie nevedú k bunkovej smrti a maximalizujú odolnosť voči napadnutiu proteázou. Jiuling duté vlákno môže byť flexibilne aplikované v následnom procese čistenia inklúznych teliesok. V kroku umývania inklúznych teliesok, vynikajúci výkon v porovnaní s odstredivým umývaním, použitie dutého vlákna na mikrofiltráciu s deviatimi vekami na filtračné umývanie s tangenciálnym tokom môže výrazne skrátiť čas procesu a všeobecná miera regenerácie môže dosiahnuť viac ako 90%. V kroku renaturácie proteínov inklúznych teliesok možno použiť aj duté vlákno Jiuling. Zákal kŕmnej kvapaliny filtrovanej mikrofiltračným dutým vláknom sa výrazne zníži a rýchlosť regenerácie proteínu je vysoká; Použitie dutého vlákna na ultrafiltráciu môže nielen odstrániť denaturačné látky, ale aj skrátiť čas nakladania chromatografickej vzorky, aby sa ušetril čas, znížil sa objem plniva a znížili sa výrobné náklady. Rýchlosť obnovy mikrofiltrácie/ultrafiltrácie dutého vlákna sa líši v závislosti od rôznych materiálov a všeobecná miera regenerácie môže dosiahnuť 90-95 %.

Guidling Technology víta, že si môžete vyžiadať testovacie súpravy pre súvisiace recenzie.

 

O Guidlingu

Guidling Technology je národný high-tech podnik so zameraním na biofarmaceutiká, bunkovú kultúru, čistenie a koncentráciu biomedicíny, diagnostiky a priemyselných tekutín. Úspešne sme vyvinuli odstredivé filtračné zariadenia, ultrafiltračné a mikrofiltračné kazety, vírusový filter, TFF systém, hĺbkový filter, duté vlákno atď., ktoré plne spĺňajú aplikačné scenáre biofarmaceutík, bunkových kultúr atď. Naše membrány a membránové filtre sú široko používané pri koncentrácii, extrakcii a separácii predfiltrácie, mikrofiltrácie, ultrafiltrácie a nanofiltrácie. Naše mnohé produktové rady, od malých jednorazových laboratórnych filtrácií až po výrobné filtračné systémy, testovanie sterility, fermentáciu, bunkové kultúry a ďalšie, spĺňajú potreby testovania a výroby. Guidling Technology sa teší na spoluprácu s vami!