Membránová technológia a čírenie vakcíny (Ⅰ)
Vakcíny pochádzajú z rôznych zdrojov, vrátane tkanivových extraktov, bakteriálnych buniek, vírusových častíc, proteínov a nukleových kyselín produkovaných cicavčími rekombinantnými bunkami, kvasinkami a hmyzími bunkami.
Najbežnejší spôsob výroby vakcíny je založený na počiatočnom fermentačnom procese, po ktorom nasleduje purifikácia. Výroba vakcíny je zložitý proces, ktorý zahŕňa mnoho rôznych krokov a procesov. Výber správnej metódy čistenia je rozhodujúci pre dosiahnutie požadovanej čistoty konečného produktu. Vyčírenie vakcín je dôležitým krokom, ktorý má významný vplyv na regeneráciu produktu a následné následné čistenie. Na objasnenie vakcín možno použiť niekoľko techník. Výber spôsobu zberu a zariadenia závisí od typu batérie, povahy zbieraného produktu a procesnej kvapaliny. Medzi tieto techniky patrí membránová filtrácia (mikrofiltrácia, filtrácia s tangenciálnym prietokom), centrifugácia a hĺbková filtrácia (filtrácia s normálnym prietokom). Z dlhodobých skúseností vyplýva, že vyčírenie zberu vakcíny sa zvyčajne dosahuje centrifugáciou, po ktorej nasleduje hlboká filtrácia.
V posledných rokoch sa pri objasňovaní vakcín do popredia dostali techniky založené na membránach. Upstream procesy čoraz viac využívajú jednorazové technológie, takže stratégie zberu sa musia zmeniť. Tento článok poskytuje komplexný prehľad rôznych membránových technológií a ich aplikácií pri objasňovaní vakcín.
01 Úvod
Vakcíny sú kritickou zložkou našej prevencie infekčných chorôb, ktoré zostávajú šokujúcou príčinou smrti. Každý rok sa vďaka imunizácii zachráni pred záškrtom, tetanom, čiernym kašľom a osýpkami 2 až 3 milióny ľudí. Vakcíny pokrývajú široké spektrum, od malých rekombinantných proteínov až po celé vírusové častice a celé baktérie. Môžu byť produkované rôznymi systémami: vajíčkami, bunkami cicavcov, baktériami atď. Kvôli zložitosti a rozmanitosti vakcín v súčasnosti neexistuje žiadny hlavný purifikačný protokol alebo šablóna, a to napriek rastúcemu záujmu o očkovacie platformy.
Typicky možno očkovací proces rozdeliť do troch častí: upstream (výroba a čírenie), následná úprava (purifikácia vrátane ultrafiltrácie, chromatografie a chemického spracovania) a formulácia (konečné plnenie). Nezávisle od výrobného systému hrá čírenie (počiatočné odstránenie nežiaducich látok) kľúčovú úlohu pri určovaní robustného procesu čistenia. Správny krok čírenia odstraňuje hlavne celé bunky, bunkové zvyšky, koloidy a veľké agregáty, aby sa znížila záťaž následného spracovania. V niektorých prípadoch môže čírenie tiež znížiť nerozpustné nečistoty, proteíny hostiteľských buniek (HCP) a nukleové kyseliny hostiteľských buniek. Ako každý iný purifikačný krok, aj krok čírenia je potrebné optimalizovať, aby sa dosiahol maximálny výťažok produktu a čistota, pričom sa prispôsobí špecifickosti a výrobným obmedzeniam vakcíny.
Kvôli heterogenite typov vakcín sa na vyčírenie používa celý rad techník, vrátane centrifugácie alebo filtrácie (tabuľka 1).
Na dosiahnutie požadovaného objasnenia je zvyčajne potrebných niekoľko sérií operácií. Prvá operácia je určená na odstránenie väčších častíc (primárne čírenie) a druhá operácia je určená na odstránenie koloidov a iných submikrónových častíc (sekundárne čírenie). Nízkorýchlostná centrifugácia slúži ako jednorazová možnosť čírenia, ktorá umožňuje odstrániť bunky a bunkové zvyšky precipitáciou. Centrifugácia dokáže zvládnuť vysoké zaťaženie pevných látok a bola široko používaná v dávkovom alebo kontinuálnom režime a diskových odstredivkách. Vyžaduje si vysoké kapitálové investície a náklady na údržbu a čelí problémom pri rozširovaní kvôli nedostatku spoľahlivého zmenšeného modelu. Niektorí komerční výrobcovia vakcín však používajú centrifúgy vo veľkovýrobe, ktorá zahŕňa vysoké objemy spracovania a viac výrobných činností.
Prečisťovacia filtrácia sa môže vykonávať filtráciou s normálnym prietokom (NFF, tiež známa ako filtrácia na slepom konci) alebo filtráciou s tangenciálnym prietokom (TFF, tiež známa ako filtrácia s priečnym tokom). Existujú aj špecifické režimy filtrov (hlboké filtre), ktoré obsahujú kladne nabité materiály a filtračné pomôcky, ktoré zlepšujú zadržiavanie zvyškov buniek, koloidov a negatívne nabitých nežiaducich zložiek.
Membránové filtre zadržiavajú častice vylúčením podľa veľkosti a nemajú vysokú schopnosť zadržiavať nečistoty, preto sú vhodné pre sekundárne kroky čistenia. Hĺbkové filtre aj membránové filtre sa dajú ľahko škálovať a implementovať (jednoduchý dizajn systému). Na rozdiel od NFF sa TFF používa hlavne na primárne čírenie (mikrofiltráciu). Membrány s medzným rozsahom 0.1-0.65 μm (najlepšie s otvoreným kanálom) boli úspešne použité na zadržiavanie buniek, bunkových zvyškov a iných veľkých kontaminantov. Väčšina zariadení TFF je lineárne škálovateľná a po vyčistení opätovne použiteľná, čo výrazne znižuje náklady na spotrebný materiál pre daný krok.
Krok čírenia leží medzi upstream a downstream procesmi a je niekedy prehliadaný počas vývoja vakcínového procesu, pretože čas a zdroje sú uprednostňované pre iné purifikačné kroky, ako je chromatografia alebo centrifugácia s hustotným gradientom.
Dokonca aj patenty na procesy výroby vakcín často vynechávajú krok objasnenia. Účinnosť čistenia priamo ovplyvňuje výkonnosť následného procesu. Zle optimalizovaný krok čírenia môže negatívne ovplyvniť kapacitu sterilizovaného filtra alebo môže skrátiť životnosť chromatografickej živice. Dnes prísnejšie regulačné očakávania vedú k tomu, že výrobcovia vakcín vyrábajú čistejšie, dobre charakterizované, ale cenovo dostupné vakcíny. V tomto prípade treba každému kroku venovať pozornosť, ktorú si zaslúži. Súčasné trendy naznačujú, že upstream proces smeruje k „čistejšiemu“ expresnému systému (tj bunky kultivované v bezsérovom médiu nahrádzajú vajíčka) so zvýšenou produktivitou a vyššou hustotou buniek.
Procesy následného čistenia sa zjednodušujú a zefektívňujú, aby sa zvýšila čistota konečného produktu. Na zvládnutie týchto zmien sa krok objasnenia nemôže stať prekážkou. V tomto prípade sa filtračná technológia stretáva s novou výzvou na objasnenie, ktorá rieši otázky zvýšenej flexibility procesu, možnosti jednorazového použitia a znížených investičných nákladov.
02 Objasnenie vírusových vakcín
Niekoľko typov metód čírenia, či už samotných alebo v kombinácii, bolo úspešne použitých na objasnenie zberu na konci podávania vakcín.
Pilotná mierka:1-20L, výrobná mierka: viac ako 20L
2.1 Preventívne opatrenia na objasnenie vírusovej vakcíny
Mnohé vakcíny obsahujú všetky alebo časť vírusových častíc na vytvorenie imunity proti vírusovej infekcii. Vo všeobecnosti spadajú do štyroch širokých kategórií:
Živá atenuovaná vakcína (LAV), ktorá je založená na oslabenom kmeni vírusu na zníženie jeho virulencie. Oslabené vírusy sa môžu v tele replikovať, ale nie sú patogénne.
- Inaktivované vírusové (IV) vakcíny, ktoré obsahujú chemicky alebo ultrafialovým žiarením inaktivované vírusy na odstránenie infekčnosti. Vírusové častice môžu byť kompletné, rozdelené alebo purifikované (iba antigénne proteíny).
- Vírusová vektorová (VV) vakcína je aktívny, nepatogénny vírus, ktorý predstavuje antigén patogénneho vírusu. Tieto nedávno vyvinuté štruktúry sa tiež používajú na aplikácie génovej terapie.
Vakcíny s časticami podobnými vírusu (VLP), špecifická trieda vírusových podjednotkových vakcín, ktoré napodobňujú celkovú štruktúru vírusových častíc, ale neobsahujú infekčný genetický materiál.
Vo väčšine prípadov sú vírusové častice úplne neporušené počas kroku čírenia, dokonca aj počas lýzy vírusovej vakcíny (štiepenie sa zvyčajne uskutočňuje v smere prúdenia, v čistejšom prostredí).
Hlavnou výzvou vírusového objasnenia je získanie vírusových častíc s vysokým výťažkom pri účinnom odstraňovaní bunkových zvyškov, veľkých agregátov a nerozpustných kontaminantov. Ako je popísané v nasledujúcich častiach, existuje niekoľko faktorov, ktoré môžu spôsobiť degradáciu alebo stratu vírusu. Okrem toho môže byť ťažké spoľahnúť sa na vírusový výťažok z dôvodu vysokej variability vírusových kvantitatívnych testovacích metód v tomto štádiu procesu, najmä pre LAV a VV vakcíny. V prípade týchto vakcín sa výťažok vírusu často hodnotí pomocou testov infekčnosti, ako je test plakov alebo test TCID50. Skutočnosť, že niektoré zo zozbieraných zlúčenín môžu interferovať so schopnosťou vírusu infikovať indikujúce bunky, zvyšuje variabilitu tohto kvantitatívneho prístupu.
2.2 Stratégia objasnenia vírusovej vakcíny
Vírusové vakcíny sa veľmi líšia veľkosťou, štruktúrou, tvarom a expresnými systémami (tabuľka 3).
V dôsledku toho vo všeobecnosti neexistuje vzor pre jeho následné procesy, najmä kroky objasňovania. Teoreticky je možné na objasnenie vírusu vybrať a potenciálne kombinovať všetky dostupné techniky (nízkorýchlostná centrifugácia, mikrofiltrácia TFF, NFF). V skutočnosti je úspech metód čírenia ovplyvnený expresným systémom a fyzikálno-chemickými vlastnosťami zahrnutých vírusov.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} buniek/ml) metóda čírenia s použitím katiónových polymérov zmenšila plochu hĺbkovej filtrácie 4-krát v porovnaní s tradičnými metódami. Táto technika umožňuje zber veľkokapacitných fermentorov bez použitia odstrediviek. Podobne Riske a spol. ukázali, že ošetrenie 40 1 bunkových kultúr (0,02 %) obsahujúcich 1.4-2,6 % pevných látok chitosanom viedlo k 7-násobnému zvýšeniu absolútnej filtračnej kapacity po hĺbkovej filtrácii.
Uvádzajú tiež, že chitosan zrejme zlepšuje účinnosť čistenia flokuláciou submikrónových častíc, ktoré sa zvyčajne usadzujú v odstredivkách. Metódy predbežnej úpravy a flokulácie budú pravdepodobne aj naďalej súčasťou budúcich objasnení filtrácie vakcín. Penetračné látky, vrátane cukrov, glykolov a aminokyselín, prednostne flokulujú vírusy. Vírusová flokulácia osmotickým roztokom nasledovaná 0.2µ mikrofiltráciou môže byť použitá ako komplexný proces na purifikáciu vírusu. Penetračné látky môžu stimulovať agregáciu vírusov znížením hydratačnej vrstvy okolo častíc na flokuláciu hydrofóbnych nezapuzdrených vírusových častíc a zapuzdrených vírusových častíc. Aj keď sa ukázalo, že penetranty flokulujú vírusy, metóda má potenciál byť platformou pre budúcu purifikáciu vakcín a jej uskutočniteľnosť v pilotnom alebo veľkom meradle vakcínovej purifikácie nebola preukázaná. Metóda predúpravy flokuláciou, ktorá bude pravdepodobne aj naďalej súčasťou budúceho čistenia filtra vakcíny, sa vykonáva v 2 1 fermentore. Aby sa tieto metódy mohli potenciálne použiť vo veľkých výrobných operáciách, musia byť overené v pilotnom a výrobnom meradle.
2.2.1 Vyjadrenie vplyvu na systém
Metóda čírenia závisí hlavne od typu upstream procesu a expresného systému, ktorý určuje typ a úroveň kontaminantov, ktoré sa majú odstrániť. Vírusové vakcíny sa zvyčajne vyrábajú v kuracích embryách kontinuálnymi bunkovými líniami cicavcov alebo vtákov alebo bakulovírusovými/hmyzovými bunkami, ktoré sú komplexnejším expresným systémom. Niektoré typy VLP môžu byť produkované aj inými heterológnymi expresnými systémami (baktérie, kvasinky, rastlinné bunky).
2.2.1.1 Vírus produkovaný v kuracích embryách
Vakcíny sa vo vajciach vyrábajú už desaťročia. Táto práca sa datuje do roku 1931, keď Woodruff a Good Pasture úspešne použili chorio-alantoidnú membránu plodných vajíčok ako substrát pre rast vírusov. V súčasnosti sa pomocou tohto starodávneho procesu stále vyrába veľa ľudských a veterinárnych vakcín. Najznámejšia je asi vakcína proti sezónnej chrípke. Princípom je inokulovať slepačie vajcia požadovanými vírusmi a potom sa replikovať v chorio-alantoidnej membráne. Po reprodukcii sa alantoická tekutina bohatá na vírusové častice zbiera a čistí.
Alantoická tekutina je náročným číriacim krmivom. Jeho vysoký obsah minerálov a bielkovín (vrátane ovalbumínu) mu dodáva vysokú viskozitu. Alantoická tekutina tiež obsahuje esenciálne tkanivové zlúčeniny z kuracích embryí, ako sú perie, zobáky, krvné cievy alebo krvinky. Kvôli vysokému obsahu pevných látok je preferovanou možnosťou primárneho čírenia nízkorýchlostné odstreďovanie, ktoré zvyčajne vedie k výťažnosti približne 70 %. Je však možné aj primárne čírenie pomocou filtračných techník. Pre NFF majú hlboké filtre na báze polypropylénu a celulózy dobré schopnosti zachytávať alantoické tekutiny. Povrchové filtre vyrobené z polypropylénu alebo hlbokých filtrov na báze celulózy môžu mať kapacitu 150-210 l/m² a znížiť zákal prietoku až 3-krát. Zariadenie TFF s otvoreným prívodným kanálom je tiež vhodné na čistenie alantoických tekutín, pretože zariadenie je vhodnejšie na minimálnu tlakovú stratu cez prívodný kanál, čím sa znižuje blokovanie kanála.
Sekundárny krok čírenia možno ľahko vykonať pomocou NFF. Kombinácia polypropylénu, celulózy a materiálov zo sklenených vlákien vo všeobecnosti vykazuje dobrú účinnosť a alternatívou k sekundárnemu kroku čírenia je použitie TFF a {{0}},65μm alebo 0,45μm mikrofiltračného membránového zariadenia a prevádzka osmotického toku ovládanie. V tomto kroku sa môže použiť zariadenie TFF s otvoreným kanálom s hydrofilnou PVDF alebo hydrofilnou PES membránou.
Je dôležité poznamenať, že vírusové častice môžu byť spojené s nerozpustným odpadovým materiálom, čo môže významne znížiť produkciu vírusu počas čírenia. Použitie soľného roztoku môže znížiť toto spojenie medzi chrípkovými vírusmi a pevnými fragmentmi, čo vedie k zhruba dvojnásobnému zvýšeniu produkcie bez ovplyvnenia integrity vírusových častíc.
2.2.1.2 Vírusy produkované v po sebe nasledujúcich cicavčích a vtáčích bunkových líniách
Nedávno sa niektoré vírusové vakcíny posunuli od procesov na báze vajec v prospech procesov založených na bunkových kultúrach (najmä v prípade vakcín proti chrípke). Hlavným dôvodom tohto prechodu je predchádzať problémom s produkciou vakcíny spojenými s embryonálnymi vajíčkami (tj nedostatku vajec, ktorý sa môže vyskytnúť v prípade vypuknutia akejkoľvek choroby hydiny). V dôsledku toho sa v súčasnosti vyvíja mnoho typov vakcín a vírusových vektorov s použitím kontinuálnych bunkových línií od cicavcov alebo vtákov, konvenčných bunkových línií (ako sú bunkové línie Vero, MDCK alebo HEK293) alebo vlastných bunkových línií.
V závislosti od expresného systému môže vírus zostať vo vnútri bunky, čo vyžaduje krok bunkovej lýzy, alebo môže zostať mimo bunky (lýza alebo pučanie). Pevná náplň a rozpustný obsah získaný z bunkovej kultúry sú oveľa čistejšie ako alantoická kvapalná fáza. Vďaka tomu sa technológia NFF ľahšie implementuje a kapacita je výrazne vyššia. Filtračná kapacita je však vysoko závislá od podmienok bunkovej kultúry, ako je hustota buniek alebo životaschopnosť buniek pri zbere. Tieto parametre ovplyvňujú množstvo bunkového odpadu a makroagregátov, ktoré môžu upchať hlboké filtre a membrány, čo vedie k zníženiu kapacity.
Thomassen a kol. poskytujú dobrý príklad objasnenia NFF. Používa sa v procese výroby inaktivovaného poliovírusu (IPV). Vero bunky kultivované na mikronosičoch sa použili na vírusovú proliferáciu s bunkovou hustotou {{0}},78 x 106 buniek/ml TOI. 75μm sito z nehrdzavejúcej ocele sa používa na predčírenie na odstránenie mikronosičov zo zberu. Dvojvrstvová trieda sa vyčistí pomocou hlbokého filtra s hustotou (0.2-2,0 μm), po ktorom nasleduje sterilizovaný filter.
Vybraná škálovateľná jednorazová jednotka bola úspešne použitá na prípravu materiálu pre klinické skúšanie Sabin IPV v mierke 350 l. V závislosti od sérotypu vírusu sa dosiahne miera obnovenia vírusu od 86 do 96 percent.
2.2.1.3 Bakulovírus/vírusom podobné častice produkované v systéme hmyzích buniek
Úvaha o bakulovírusových/hmyzích bunkových systémoch na výrobu vakcín vo veľkom meradle je relatívne nová, ale priťahuje rastúci záujem v oblasti vírusových vektorov a VLP. Hlavnou výhodou tohto systému je, že zahŕňa krátkodobú (nie je potrebné zakladať bunkové línie) a bezpečnú (žiadna úplná vírusová DNA) produkciu. Existujú aj niektoré nevýhody, ako je potreba odstránenia bakulovírusu a stabilita produktu.
Cervarix, VLP vakcína proti infekcii ľudským papilomavírusom produkovaná spoločnosťou GlaxoSmithKline, je prvou ľudskou vakcínou, ktorá sa komerčne vyrába v hmyzích bunkách. V súčasnosti sa vyvíja množstvo vakcín založených na VLP a rAAV vektoroch produkovaných v hmyzích bunkách infikovaných bakulovírusom. Najbežnejšie používané hmyzie bunkové línie odvodené od Spodoptera frugiperda (Sf9 a Sf21) a ohýbača kapustového Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 bunky) sú najčastejšie používané kvôli ich schopnosti rásť v suspenzii, čo zjednodušuje amplifikáciu upstream proces. Po raste na požadovanú hustotu živých buniek sa tieto bunky infikujú rekombinantným bakulovírusom vo fáze exponenciálneho rastu buniek na expresiu proteínu. Veľký genóm bakulovírusov umožňuje expresiu piatich alebo viacerých rôznych proteínov, čo zodpovedá komplexnosti VLP a vírusových vektorov.
Bernard a spol. opísali následný proces bunkovej kultúry hmyzu. Proces je veľmi variabilný, čo odráža rozmanitosť proteínov produkovaných touto technikou. Prvý krok purifikačnej sekvencie je silne ovplyvnený objemovými charakteristikami bioreaktora (tj hustotou a životaschopnosťou buniek) alebo povahou uvoľňovania produktu (vylučovaného pučaním alebo lýzou buniek). Bakulovírusová infekcia hmyzích buniek môže spôsobiť lýzu buniek do 3-5 dní. Deštrukcia buniek môže viesť k zvýšeniu proteolytickej aktivity a iných environmentálnych faktorov, ktoré môžu viesť k degradácii rekombinantných proteínov.
Boli pokusy vyvinúť bakulovírusy s nižšou schopnosťou iniciovať bunkovú lýzu. Bakulovírus lyzuje menej ako 10 percent infikovaného hmyzu.
Bunková lýza sa môže uskutočniť použitím rôznych metód, ako je zmrazovanie a rozmrazovanie, detergenty, homogenizátory alebo ošetrenie ultrazvukom. Bunky hmyzu nemajú bunkovú stenu, a preto sa rýchlo rozpúšťajú. Hoci ultrazvukové ošetrenie bolo zaznamenané v mnohých procesoch na stolici, zriedka sa používa v experimentálnom alebo komerčnom meradle. Najbežnejšou metódou je použitie homogenizátora na zničenie buniek v prítomnosti detergentu s nízkou koncentráciou (0.1% Triton X-100 alebo NP-40). Použitie detergentov a mikrofluidizácia alebo osmotická nárazová homogenizácia boli úspešne použité v mnohých výrobných procesoch vo veľkom meradle. Typicky sú bunky hmyzu suspendované v lyzačných pufroch (50mM TRIS pH 7,7, 300mM NaCl, 5% glycerol, 0,2mM PMSF a inhibítory proteázy), počas ktorých Triton-X100 sa pridá do konečnej koncentrácie 0,1 %, po čom nasleduje mierny ultrazvuk alebo mikrofluidizácia. Zmes sa potom odstredí, aby sa odstránili nerozpustné častice.
V tomto štádiu sa lyzát môže javiť ako veľmi zakalený a je ťažké ho filtrovať pomocou 0.45μm filtra. Niekedy možno pozorovať straty až 30 % počas kroku pyrolýzneho čírenia. Pridanie benzoenzýmov v štádiu štiepenia pomáha vyriešiť problém s filtráciou. Čistenie buniek soľankou s fosfátovým pufrom po zbere a rýchle „zmrazenie-rozmrazenie“ vo vysokej soli (500 mM NaCl) obsahujúcej krakovací pufor pomáha odstrániť agregáty.
K objasneniu VLP a vírusových vektorov produkovaných hmyzími bunkami dochádza po lýze buniek (chemickým alebo mechanickým spracovaním), pri ktorej sa uvoľňujú nielen vírusové častice, ale aj veľké množstvá bunkovej nukleovej kyseliny. Bunky hmyzu sú schopné rásť pri vysokej hustote buniek od 1-9.10 6 buniek/ml. Krok čírenia by sa preto mal zaoberať vysokou hustotou buniek, vysokým obsahom nukleových kyselín a, ak je to možné, odstránením bakulovírusových častíc. Aby to bolo ešte komplikovanejšie, VLP alebo vírusové vektory a bakulovírusy môžu mať podobné veľkosti (bakulovírusy majú šírku 60-80 nanometrov a dĺžku 300-400 nanometrov). Vzhľadom na vysokú hustotu buniek bola centrifugácia už desaťročia preferovanou technikou primárneho čírenia. Membránové procesy sa však zdajú byť veľmi atraktívnou alternatívou, pretože škálovateľnosť sa dá ľahko definovať.
Hĺbkové filtre boli efektívne použité v následnom procese trojvrstvových častíc podobných rotavírusom. Na laboratórnej úrovni sa na čistenie týchto komplexných častíc často používa metóda ultracentrifugácie s hustotným gradientom CsCl. Výskumníci hodnotili nielen krok čírenia hlbokého filtra, ale aj celý následný proces (štiepenie Triton X-100 a hĺbková filtrácia, po ktorej nasleduje ultrafiltrácia a vylúčenie veľkosti častíc). Výsledky ukazujú, že výťažok hustotného gradientu CsCl môže dosiahnuť 37 %.
Ultra-odstredivá metóda je približne 10%. Ako ďalší príklad sa použili 0,45 μm duté vlákna a vlákna s jemným priemerom 500 kDa na získanie a koncentráciu častíc podobných HIV produkovaných v bunkách hmyzu. V tejto štúdii bola šmyková sila dutých vlákien optimalizovaná na základe integrity buniek. Výsledky Na nahradenie ultracentrifugácie v gradiente stolového cukru bol zavedený proces s nízkou šmykovou silou.
Proces má potenciál byť aplikovaný na sériovú výrobu. Hlboké filtre boli tiež úspešne použité pri produkcii rekombinantných adeno-asociovaných vírusov. Lýza buniek sa uskutočnila dvojpiestovým mechanickým rušičom buniek, po ktorom nasledovalo ošetrenie nukleázou. V kroku čírenia sa použil 1,2 μm hlboký filtračný prvok zo sklenených vlákien, po ktorom nasledovali dve vrstvy 0,8μm hydrofilného PES a 0,2μm hydrofilného PES. Filtre s proporcionálnou veľkosťou sa používajú na spracovanie dávok od menších do veľkosti 200 L. Hlboké filtre sa úspešne použili a hodnotenie TFF s plochými filmami alebo dutými vláknami s hrúbkou 0,2 um alebo 0,45 um sa tiež uvádza ako veľmi účinné.
Štúdia spoločnosti Tecnologica (IBET) na Oeiras Institute of Experimental Biology v Portugalsku použila NFF na objasnenie VLP hepatitídy C exprimovanej bakulovírusmi bez centrifugácie. Nominálne hodnotené polypropylénové filtre (10,5,0.6 a 0.3μm) filtre sa používajú na čistenie VLP zberu. Rovnaké filtre s veľkosťou pórov 0,6μm a 0,3μm sa používajú na filtráciu v centrách na zber VLP. Všetky študované filtráty boli testované na rýchlosť regenerácie HCV-VLP a boli porovnané odporúčané filtračné metódy. Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.
Výsledky ukázali, že 5μm-0.3μm filter mal najvyššiu výťažnosť produktu (100 %) pre priamo zozbierané krmivo VLP s hepatitídou C. Polypropylénový 0,6 μm filter mal najvyššiu výťažnosť produktu (82 %) pre centrálny prívod a klírens DNA hostiteľskej bunky bol približne 70 %.
2.2.1.4 Vírusom podobné častice produkované v bakteriálnych alebo kvasinkových systémoch
Typ metódy čírenia VLP vakcín exprimovaných v bakteriálnych alebo kvasinkových systémoch závisí od uvoľňovania VLP do extracelulárnych mediátorov. Ak nie je možné účinne vylučovať VLP, pred samotným krokom čírenia môže byť potrebná lýza buniek alebo iné extrakčné kroky. Zatiaľ čo toto je zlatý štandard v priemysle čírenia bielkovín, centrifugácia (kontinuálna alebo dávková) vyjadrená v bakteriálnych alebo kvasinkových systémoch, v poslednej dobe sa membránové procesy stali veľmi atraktívnou alternatívou vďaka ich ľahkej škálovateľnosti a kompatibilite s jednorazovým použitím. liečby.
Richter a Topell vysvetľujú použitie centrifugácie, TFF alebo kombinácie oboch pri príprave VLP produkovaných v prečistenej E. coli. V ich práci sa použili 0.45m TFF membrány na riedenie a vyčírenie homogenizovaných homogenátov E. coli pri teplote 5 stupňov . Tiež poznamenávajú, že membránový TFF je vhodný na manipuláciu so zberom s vysokou viskozitou, výhodne s použitím TFF jednotiek s konfiguráciou otvorených kanálov.
Odstredivé čírenie bolo tiež hodnotené ako alternatíva k TFF. V tomto prípade sa výsledný homogenát neriedil a centrifugoval pri 4 stupňoch počas 105 minút, 10000g. Bez prenosu mäkkého povlaku sa supernatant vylial z častíc a znova sa centrifugoval pri 4 stupňoch a 10 000 g počas 60 minút. Supernatant sa potom odstránil z prítomných častíc, zriedil sa EB pufrom (43,89 mM Tris HCI, 6,11 mM Tris báza, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 a prefiltroval sa na 0,22 m sterilnom filtračnom zariadení. Ďalšie spracovanie. Postup pri výrobe tejto VLP vakcíny v E. coli v 800 1 mierke bol tiež údajne objasnený kombináciou centrifugácie a TFF.
Rekombinantná vakcína proti hepatitíde E HEV 239 bola v Číne licencovaná na imunizáciu dospelých vo veku 16 rokov a starších. Vakcínové antigény (VLP) sú exprimované v E. coli a bolo preukázané, že zväčšenie procesu produkcie antigénu je na 50l mierke. Produkt sa extrahoval krakovaním E. coli a inklúzne telieska sa oddelili od bunkových fragmentov silným premytím tlmivým roztokom obsahujúcim 2 % Triton X-100 a potom sa rozpustili v 4M homogenizátore s močovinou. TFF objasňuje VLP ľudského papilomavírusu produkovaného v Saccharomyces cerevisiae (15L). Bunkový lyzát ošetrený nukleázou sa vyčistil mikrofiltráciou s priečnym tokom v režime transfiltrácie s použitím 0,65 um filtra z dutých vlákien. Rovnaký proces sa používa pri výrobe vakcín. Hoci len niekoľko vakcín na báze VLP dosiahlo komerčný rozsah, niekoľko vakcín na báze VLP je vo vývoji, z ktorých väčšina je objasnená pomocou centrifugácie alebo membránovej technológie.
Obmedzení vplyvom priestoru sa o druhú polovicu obsahu podelíme v ďalšej kapitole. V nasledujúcom článku sa podelíme o niektoré prípady objasnenia vakcín a použitia príslušných membránových komponentov.
Guidling Technology ako prvá spoločnosť v lokalizačnom okruhu nazbierala dostatočné relevantné skúsenosti s objasňovaním vakcín. Guidling Technology je vývojová a produkčná spoločnosť so zameraním na biofarmaceutické a bunkové kultúry, purifikáciu a separáciu. Produkty sú široko používané v biomedicíne, diagnostike, priemyselnej filtrácii tekutín, detekcii, čírení, čistení a koncentrácii; Guidling úspešne vyvinul ultrafiltračnú odstredivkovú skúmavku, ultrafiltračnú/mikrofiltračnú membránovú kazetu, filter na odstraňovanie vírusov, filtračné zariadenie s tangenciálnym prietokom, hlboký membránový zásobník atď., Ktoré plne spĺňajú aplikačné scenáre biofarmaceutických a bunkových kultúr.
Naše membrány a membránové filtre sa široko používajú pri koncentrácii, extrakcii a separácii predfiltrácie, mikrofiltrácie, ultrafiltrácie a nanofiltrácie. Naša široká škála produktových radov, od malých jednorazových laboratórnych filtrácií až po produkčné filtračné systémy, testovanie sterility, fermentáciu, bunkové kultúry a ďalšie, dokáže vyhovieť potrebám testovania a výroby.
